一种水凝胶复合神经导管的制备方法

本发明涉及一种水凝胶复合神经导管的制备方法，属于神经组织再生领域。

背景技术：

1、周围神经损伤（peripheral nerve injury，pni）每年影响超过100万人，经常由外伤引起，并可能导致感觉或运动功能的严重丧失。尽管人的外周神经在受伤后能够再生，但这种自发过程的再生效果非常有限，不足以实现功能的恢复。此外，神经间隙的长度，损伤程度以及损伤与治疗之间的时间间隔，患者的年龄也是影响功能恢复的一些因素。因此采用合适的方法对周围神经损伤进行修复是一个亟待解决的问题，比较常见的一种方法是采用神经自体移植的外科手术。但这种方法除供体神经不足，来源有限以外，还会造成供体部位部分功能丧失外，供体部位发病、和功能恢复不足等缺陷，严重影响患者的生活质量，并且这种方法移植成功率较低。

2、目前，静电纺丝已被大量用于生产神经导管，神经导管必须良好的生物相容性、适当的生物降解性和合适的机械性能。玉米醇溶蛋白是一种从玉米蛋白粉中提取的蛋白质，通过二硫键聚集在玉米中，分子量约为25-35 kda。作为一种植物蛋白，玉米醇溶蛋白已被证明具有低免疫原性和高体内降解潜力。此前的研究证实，玉米醇溶蛋白神经导管的孔隙结构可以减轻早期炎症，促进巨噬细胞极化至m2表型，加速神经再生。由于玉米醇溶蛋白中非极性氨基酸比例较高，限制了其在医药中的广泛应用，通过在玉米醇溶蛋白中引入不同的亲水基团，可以改变分子与水之间的相互作用。另外，通过加热、超声波等物理方法处理玉米醇溶蛋白，可以破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白质分子内部的一些亲水基团暴露在蛋白质分子表面，可以提高玉米醇溶蛋白的溶解度。

3、l-半胱氨酸作为还原剂，能够清除蛋白质分子内部和分子间的二硫键，推动巯基与二硫键的交换反应，进而对蛋白质进行修饰。根据其氨基酸组成对玉米醇溶蛋白进行水解，可以显着改变蛋白质的结构，从而改善其功能特性。水解条件温和，局部水解产生具有特定生物活性的肽。在炎症导致琉基酶下降的情况下，补充l-半胱氨酸能够保持琉基酶的功能，从而缓解炎症的表现。玉米醇溶蛋白的修饰是通过不同的方法引入或去除特定基团来实现的，改善了玉米醇溶蛋白的表面性质，提高了玉米醇溶蛋白与其他物质的相容性和结合力。

4、果胶由α1-4糖苷键连接的d-半乳糖醛酸单元组成，果胶和果胶基复合材料通过在体内形成细胞外基质,刺激细胞粘附和细胞增殖,增强组织重构,成为相互作用的基质或导管。一些生物活性特性,如免疫调节、抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗氧化活性,有助于促进果胶和果胶基复合材料在组织工程和药物传递系统中的应用。含有果胶和果胶基共轭物或复合材料的组织工程导管具有非毒性、可调谐力学性能、生物降解性和合适的表面性能等基本特征。果胶复合材料的设计和制造在组织工程和药物输送方面具有广泛的应用价值。然而果胶的热稳定性差，机械性能差，但与其他生物聚合物结合使用时，这些都可以得到改善。

5、氧化石墨烯是石墨烯的主要衍生物，具有石墨烯的性能（如机械延性、导电性和刚度），并且比原始石墨烯具有更好的生物相容性和更高的亲水性。氧化石墨烯可以加速雪旺细胞的迁移、增殖和髓鞘化，以及pc12细胞的分化。体内研究还显示，氧化石墨烯/还原氧化石墨烯通过调节细胞内活性氧和氮的表达，以及akt-一氧化氮合酶-血管内皮生长因子信号通路，允许神经发生、免疫调节和血管生成反应。与还原氧化石墨烯相比，氧化石墨烯具有更好的生物相容性、降解行为和更高的电导率。

6、小檗碱是一种异喹啉类生物碱的天然产物，主要从黄连和其他小檗碱植物中分离出来。小檗碱具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、免疫调节和抗菌活性，是一种很有前途的对抗神经炎症的药物， jia等人发现，补充小檗碱可以通过抑制nf-kb和mapk信号通路的激活来抑制aβ诱导的小胶质细胞炎症反应。

技术实现思路

1、为了提高神经导管促进神经再生与修复的疗效，本发明提供一种水凝胶复合神经导管的制备方法。

2、为实现上述目的，本发明使用了以下技术方案：

3、一种水凝胶复合神经导管的制备方法，包括以下步骤：

4、1）将3g玉米醇溶蛋白溶解于60-90%乙醇水溶液中，加入0.15-0.9mmol半胱氨酸反应，然后用超纯水透析，将透析液冷冻干燥得到半胱氨酸化玉米醇溶蛋白；

5、2）将半胱氨酸化玉米醇溶蛋白和小檗碱溶解于60-90%的乙醇水溶液中，配制成半胱氨酸化玉米醇溶蛋白含量为20-35%、小檗碱含量为1-5%的溶液，然后进行静电纺丝，得到中空神经导管；

6、3）将玉米醇溶蛋白粉末溶解在60-90%乙醇水溶液中配置成2-5%的溶液；将果胶粉末和氧化石墨烯溶解在1-5%cacl2溶液中，配置成果胶含量为5-10%、氧化石墨烯含量为0.04-0.16%的溶液；将两种溶液按1：0.5-3的体积比混合，搅拌形成溶胶；

7、4）将步骤3）的溶胶填充于步骤2）的中空神经导管中，-80℃下冷冻干燥，即得水凝胶复合神经导管。

8、优选地，步骤1）中，所述半胱氨酸的加入量为0.6mmol。

9、优选地，步骤2）中，所述半胱氨酸化玉米醇溶蛋白含量为30%、小檗碱含量为2%。

10、优选地，步骤2）中，所述静电纺丝的参数为：流出速度为0.2 mm/min，针管与接收板之间的电压为20kv，接收距离为15cm，环境温度为25℃，相对湿度为40%。

11、优选地，步骤3）中，所述玉米醇溶蛋白溶液的浓度为3%。

12、优选地，步骤3）中，所述果胶含量为6%、氧化石墨烯含量为0.12%。

13、优选地，步骤3）中，所述两种溶液的体积比为1：2。

14、本发明中所涉及的乙醇水溶液浓度均为体积浓度，例如60-90%乙醇水溶液，指的是每100ml乙醇水溶液中含有乙醇60-90ml，除此之外，本发明中的其它含量百分比均为重量比。

15、本发明的有益效果是：

16、1)本发明提供的半胱氨酸改性后的玉米醇溶蛋白使其由疏水性材料变成两性材料，从而有利于神经细胞的粘附和增殖，再通过静电纺丝技术纺成中空神经导管，其中载有具有抗炎作用的小檗碱。神经导管表现出较好的机械强度、弹性、可控的生物降解性、药物的缓慢释放且具有良好的细胞增殖效果。

17、2)本发明提供的通过化学交联玉米醇溶蛋白和果胶合成水凝胶，并在水凝胶中添加具有导电作用的氧化石墨烯，以进一步支持神经再生。水凝胶在四周内表现出快速凝胶、良好的导电性、完全生物降解且相较于其他水凝胶更有利于神经细胞的粘附和增殖等最佳性能。

技术特征：

1.一种水凝胶复合神经导管的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的水凝胶复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述半胱氨酸的加入量为0.6mmol。

3.如权利要求1所述的水凝胶复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述半胱氨酸化玉米醇溶蛋白含量为30%、小檗碱含量为2%。

4.如权利要求1所述的水凝胶复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述静电纺丝的参数为：流出速度为0.2 mm/min，针管与接收板之间的电压为20kv，接收距离为15cm，环境温度为25℃，相对湿度为40%。

5.如权利要求1所述的水凝胶复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述玉米醇溶蛋白溶液的浓度为3%。

6.如权利要求1所述的水凝胶复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述果胶含量为6%、氧化石墨烯含量为0.12%。

7.如权利要求1所述的水凝胶复合神经导管的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述两种溶液的体积比为1：2。

技术总结本发明公开了一种水凝胶复合神经导管的制备方法，通过半胱氨酸改性使玉米醇溶蛋白由疏水性材料变成两性材料，有利于细胞的粘附和增殖；采用静电纺丝技术制备神经导管，改善了小檗碱的释药性能；采用化学和物理交联果胶和玉米醇溶蛋白合成水凝胶，在水凝胶中添加具有导电作用的氧化石墨烯并填充于神经导管中，进一步促进了神经再生。本发明所制备的神经导管表现出较好的机械强度和可控的生物降解性，药物能缓慢释放并具有良好的促进细胞增殖效果。技术研发人员：徐海星,许润天,许沛虎,吴向杰,陈佳路,姚怡婷,黄志军,陈芷桐,孙熙元受保护的技术使用者：武汉理工大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2