一种基于肝原代细胞的维生素B3缺乏模型制备方法和应用

本发明属于生物工程技术，具体而言，涉及一种基于肝原代细胞的维生素b3缺乏模型制备方法和应用。

背景技术：

1、维生素b3是一种水溶性维生素，其在体内代谢成为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)，后者在细胞稳态中发挥重要作用。nad+是多种脱氢酶的辅酶，参与体内500多种酶促反应，在能量代谢和信息传递中发挥重要作用。同时，nad+及其还原形式nadh是线粒体氧化还原反应的关键因子，对于维持线粒体氧化还原稳态至关重要。此外，nad+是sirtuins、parps、cd38及sarm1等信号酶的关键底物，在许多进化上保守的信号通路中发挥重要调节作用，如dna修复、细胞凋亡、基因组信号、内分泌信号、衰老、增殖、炎症、线粒体功能、脂质和葡萄糖稳态等。

2、长期维生素b3摄入不足的人群健康风险。消化系统疾病、慢性酒精中毒、感染性疾病、类癌综合征及长期服用药物(如异烟肼、氟脲嘧啶以及磺胺、抗惊厥药、抗抑郁药)等患者中也常出现维生素b3缺乏症状。更重要的是，肥胖和衰老的人群nad+水平显著低于健康人群。因此，持续研究维生素b3缺乏对健康的影响十分必要。

3、肝脏是人体最大的代谢器官，也是维生素b3代谢的主要场所。在肝细胞中，nad+合成途径主要有5种(见图1)。肝原代细胞是营养代谢和细胞生物研究中常用的研究材料，被广泛用于临床前活体外的高通量测定，比如转录组学、蛋白组学、代谢组学等。

4、目前已知的四种食源性维生素b3包括烟酸(nicotinic acid，na)、烟酰胺(nicotinamide，nam)、烟酰胺核糖苷(nicotinamide riboside，nr)、烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，nmn)，其均可在体内被代谢为nad+。此外，必需氨基酸色氨酸(tryptophan，trp)可通过从头合成途径(de novo pathway)代谢成为nad+，其转化效率约为烟酸效价的1/60，但仍对肝脏等组织的nad+池有显著影响。

5、目前在活体外水平构建维生素b3缺乏模型的技术方法主要有两种，一是利用维生素b3代谢关键酶烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)的特异性抑制剂fk866处理研究对象，二是采用基因编辑的方式(如sirna敲除维生素b3代谢关键酶基因nampt或者过表达消耗酶基因cd38)。这两种方案的共同存在问题是：1.仅靶向维生素b3代谢的一种途径进行限制，无法反映维生素b3代谢的复杂性；2.靶向效率问题，如fk866抑制剂其特异性非100％，对非靶标蛋白或酶活性(如sarm1)也具有抑制效应；sirna敲低nampt基因是瞬时敲除，具有有限的时效性，且敲除效率具有较大变异性。因此，以上方案无法充分模拟因维生素b3摄入不足而导致其缺乏的生理状态。

6、本发明设计一种新型的模型构建的方法，通过对肝原代细胞的dmem培养基成分和细胞培养过程的优化，设计一种新型的维生素b3缺乏的生理模型构建方法，以模拟因维生素b3摄入不足而导致细胞维生素b3缺乏的生理状态，并实现低成本、高效率的实验目的。

技术实现思路

1、本发明首先提供了一种基于肝原代细胞的维生素b3缺乏模型制备方法，所述方法包含以下步骤：

2、(1)提取肝原代细胞，并将肝原代细胞用dmem培养基(含血清)种植到培养皿上，种植后5-6小时左右，换液，换dmem培养基(含血清)；

3、(2)次日换培养基，肝细胞缺乏维生素b3模型构建组换有维生素b3缺乏培养基(含血清)；

4、(3)第三日，肝细胞缺乏维生素b3模型构建组换维生素b3缺乏培养基(无血清)；

5、(4)第四日，肝细胞缺乏维生素b3模型构建组换维生素b3缺乏培养基(无血清)，持续培养。

6、在某些实施例中，所述dmem培养基(含血清)为在dmem培养基(无血清)(hyclone，sh30022.01)中添加10％的胎牛血清和1％的抗生素；

7、所述维生素b3缺乏培养基(无血清)组分为将商用dmem高糖培养基(hyclone，sh30022.01)中维生素b3成分进行删除，并且调低了色氨酸(l-tryptophan)含量至10.2mg/l；

8、所述维生素b3缺乏培养基(含血清)为在维生素b3缺乏培养基(无血清)中添加10％的胎牛血清和1％的抗生素。

9、在某些实施例中，所述方法还包含步骤(6)对肝原代细胞的细胞数量、细胞活性和细胞nad+代谢组进行检测。

10、在某些实施例中，所述细胞数量指标采用韩国curiosis全自动细胞计数仪及配套的细胞计数板按照厂家推荐操作规范进行检测。

11、在某些实施例中，所述细胞活性采用增强型cck8试剂盒按照厂家推荐操作规范进行检测。

12、在某些实施例中，所述细胞数量指标采用结晶紫染色液(碧云天，中国，c0121)，按照厂家推荐操作规范进行检测。

13、在某些实施例中，所述细胞的nad+代谢组使用高效液相色谱质谱联用的方法进行检测。

14、本发明还提供了如上述的方法的应用，所述应用为构建维生素b3缺乏模型。

15、本发明还提供了一种基于肝原代细胞的维生素b3缺乏模型，所述模型由上述的方法制备获得。

16、本发明最后提供了上述的模型的应用，所述应用为筛选维生素b3的新机理和新用途。

17、本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：

18、本发明从营养素限制的角度出发，对dmem细胞培养基的成分进行了调整，通过该定制培养基对肝原代细胞进行传代培养使其达到维生素b3缺乏状态，维生素b3缺乏模型构建成功率可达95％以上。本发明可使肝原代细胞充分表现出因维生素b3摄入不足而导致其缺乏的生理状态，维生素b3缺乏模型构建成功后可用定制培养基传代细胞使其继续维持维生素b3缺乏生理状态，可满足不同的实验需求，具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.一种基于肝原代细胞的维生素b3缺乏模型制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dmem培养基(含血清)为在dmem培养基(hyclone，sh30022.01)中添加10％的胎牛血清和1％的抗生素；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包含步骤(5)对肝原代细胞的细胞数量、细胞活性和细胞nad+代谢组进行检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞数量指标采用韩国curiosis全自动细胞计数仪及配套的细胞计数板按照厂家推荐操作规范进行检测。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞活性采用增强型cck8试剂盒按照厂家推荐操作规范进行检测。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞的nad+代谢组使用高效液相色谱质谱联用的方法进行检测。

7.一种如权利要求1-6任一所述的方法的应用，其特征在于，所述应用为a)构建维生素b3缺乏模型b)营养素功效评价研究。

8.一种基于肝原代细胞的维生素b3缺乏模型制备方法，其特征在于，所述模型由权利要求1-6任一所述的方法制备获得。

9.一种如权利要求8所述的模型的应用，其特征在于，所述应用为筛选维生素b3的新机理和新用途。

技术总结本发明属于生物工程技术，公开了一种基于肝原代细胞的维生素B3缺乏模型制备方法和应用；所述方法包含以下步骤：(1)提取肝原代细胞，并将肝原代细胞用DMEM培养基(含血清)种植到培养皿上，种植密度为5×10<supgt;5</supgt;/mL，种植后5‑6小时左右，换DMEM培养基(含血清)；(2)次日换培养基，肝细胞缺乏模型构建组换有维生素B3缺乏培养基(无血清)；(3)第三日，肝细胞缺乏模型构建组换维生素B3缺乏培养基(无血清)；(4)第四日，肝细胞缺乏模型构建组换维生素B3缺乏培养基(无血清)，持续培养。本发明模型构建成功率可达95％以上。本发明采用优化细胞培养基和细胞培养方案的手段，可使肝原代细胞充分表现出因维生素B3摄入不足而导致其缺乏的生理状态，可作为原代细胞的基础生理模型满足不同的实验需求，具有广泛的应用前景。技术研发人员：石文标,张冰艳,肖维汉,陈璐,罗洁,安杰,罗永挺,李凯风,高钧照,耿源,陈宇受保护的技术使用者：中国农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/2