一种凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂及其制备方法与应用

本发明涉及微生物保存，更具体的说是涉及一种凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂及其制备方法与应用。

背景技术：

1、凝结芽孢杆菌是一种能形成孢子、产乳酸的兼性厌氧菌，其最适的生长温度和ph值分别为35-50℃和6.6-7.0。凝结芽孢杆菌具有改善肠道功能、促进消化吸收、降低胆固醇、免疫调节作用等医学特性。有研究表明，凝结芽孢杆菌不具有诱变性或遗传毒性，消费者可长期使用该菌株。与传统的商业益生菌相比，凝结芽孢杆菌能够在强酸和胆汁的环境下生存，在肠道中更好的发挥益生作用。目前市面上也出现了许多含有凝结芽孢杆菌的功能食品，如软糖、冰淇淋和面包等。

2、凝结芽孢杆菌作为一种益生菌，在液体状态下，容易受到温度、ph值等环境因素的影响，导致其存活率相对较低。为了延长凝结芽孢杆菌的保存时间，提高凝结芽孢杆菌的活性，通常运用冷冻干燥技术将其制成固态制剂。在整个过程中，凝结芽孢杆菌被冻结并且在低温环境下进行干燥，从而保持其活性和稳定性，使得其能够长期保存。在冷冻干燥过程中，为了降低冷冻干燥和随后的复水化过程对细胞带来的损伤，通常会使用冻干保护剂。保护剂可以有效地减少冰晶对细胞的损伤，降低细胞膜破裂的风险，从而提高益生菌的存活率。然而有研究称，仅靠单一的保护剂配方提供的保护作用并不理想，且由于碳水化合物类保护剂的乳化性较差，以及冻干后疏松多孔抗机械压力差，不足以有效保护。

3、因此，提供一种保护效果更优的凝结芽孢杆菌冻干保护剂是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂及其制备方法与应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂，由9.2-10.5％(m/v)的脱脂乳粉溶液、10-11.5％(m/v)的低聚果糖溶液和4.7-5.4％(m/v)的谷氨酸钠溶液等比例复配而成。

4、作为优选的方案，所述脱脂乳粉溶液的浓度为9.6％(m/v)，所述低聚果糖溶液的浓度为10.9％(m/v)，所述谷氨酸钠溶液的浓度为5.1％(m/v)。

5、本发明的另一目的是，提供上述凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂的制备方法，按照各自浓度配制脱脂乳粉溶液、低聚果糖溶液和谷氨酸钠溶液，分别灭菌冷却后按比例复配。

6、作为优选的方案，所述脱脂乳粉溶液灭菌为108℃下灭菌10min，所述低聚果糖溶液和所述谷氨酸钠溶液的灭菌方法均为115℃下灭菌15min。

7、本发明的另一目的是，提供一种利用上述凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂保存凝结芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：将培养至稳定前期的凝结芽孢杆菌菌液经离心收集菌体、生理盐水洗涤，再次离心收集菌体，将所得湿菌体用2倍体积的生理盐水重悬后，与等体积的凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂混合均匀，在-20℃预冻12h，再冷冻干燥36h。

8、作为优选的方案，所述离心收集菌体的参数为4℃下8000r/min离心10min，所述生理盐水的浓度为0.85％，且生理盐水洗涤菌体的次数为两次。

9、作为优选的方案，所述冷冻干燥的参数为真空度55pa，温度-82℃。

10、作为优选的方案，预冻前，将凝结芽孢杆菌及复合冻干保护剂的混合溶液分装于西林瓶中，盖上无菌胶塞。

11、有益效果：本发明凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂配方，其中，脱脂乳粉所含的蛋白质能在细胞外形成保护层，保护细胞免受损伤，并使细胞与氧气隔绝；低聚果糖的tg相对较高，可通过保护菌体细胞膜的完整性提升菌体的稳定性，同时能够与磷脂分子形成氢键，从而减少体系中水与磷脂的相互作用，形成的低聚果糖磷脂双分子层保护膜能够提升菌体细胞膜在冻干过程中的完整性和流动性；谷氨酸钠是一种分子量较小的氨基酸，可以通过细胞膜进入细胞，减缓冻干过程中冰晶生长，从而减小冷冻对细菌造成的伤害，本发明将这三种保护剂复配发现在一定比例关系下具有协同增效的效果，可显著提升凝结芽孢杆菌冻干存活率。

技术特征：

1.一种凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂，其特征在于，由9.2-10.5％(m/v)的脱脂乳粉溶液、10-11.5％(m/v)的低聚果糖溶液和4.7-5.4％(m/v)的谷氨酸钠溶液等比例复配而成。

2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂，其特征在于，所述脱脂乳粉溶液的浓度为9.6％(m/v)，所述低聚果糖溶液的浓度为10.9％(m/v)，所述谷氨酸钠溶液的浓度为5.1％(m/v)。

3.权利要求1或2所述凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂的制备方法，其特征在于，按照各自浓度配制脱脂乳粉溶液、低聚果糖溶液和谷氨酸钠溶液，分别灭菌冷却后按比例复配。

4.根据权利要求3所述的凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述脱脂乳粉溶液灭菌为108℃下灭菌10min，所述低聚果糖溶液和所述谷氨酸钠溶液的灭菌方法均为115℃下灭菌15min。

5.一种利用权利要求1或2所述凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂保存凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：将培养至稳定前期的凝结芽孢杆菌菌液经离心收集菌体、生理盐水洗涤，再次离心收集菌体，将所得湿菌体用2倍体积的生理盐水重悬后，与等体积的凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂混合均匀，在-20℃预冻12h，再冷冻干燥36h。

6.根据权利要求5所述保存凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述离心收集菌体的参数为4℃下8000r/min离心10min，所述生理盐水的浓度为0.85％，且生理盐水洗涤菌体的次数为两次。

7.根据权利要求5所述保存凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，所述冷冻干燥的参数为真空度55pa，温度-82℃。

8.根据权利要求5所述保存凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于，预冻前，将凝结芽孢杆菌及复合冻干保护剂的混合溶液分装于西林瓶中，盖上无菌胶塞。

技术总结本发明公开了一种凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂及其制备方法与应用，涉及微生物保存技术领域。本发明一种凝结芽孢杆菌复合冻干保护剂，由9.6％(m/v)的脱脂乳粉溶液、10.9％(m/v)的低聚果糖溶液和5.1％(m/v)的谷氨酸钠溶液等比例复配而成。本发明三种保护成分，协同增效，显著提升了凝结芽孢杆菌冻干存活率。技术研发人员：李璐,徐玉娟,刘俊杰,陈宁宁,余元善,吴继军,彭健,邹波,程丽娜,卜智斌受保护的技术使用者：广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所技术研发日：技术公布日：2024/9/2