鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法

本发明涉及干细胞培养的，具体涉及鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法。

背景技术：

1、随着生命科学与医疗技术的蓬勃发展，干细胞因其特有的分化、增殖及组织修复潜能，使其在生物医药产业中的作用日趋显现。无论是从全球干细胞相关公司数量、市值的大幅增长，或是美国食品药物管理局（fda）接受以干细胞申请的临床案件的逐年上升等情况来看，均显示出干细胞治疗已成为国际生物科技产业重点发展项目。此外，基于干细胞的培养肉的出现，也为干细胞应用开辟了新的方向，无论是干细胞治疗，还是干细胞的其他应用，首先要解决的都是其大规模培养问题。

2、鹿茸是目前所知的唯一能够完全再生的哺乳动物器官，且其生长速度可达2cm/d。鹿茸完全再生和快速生长能力主要由于鹿茸干细胞的存在。经鉴定，鹿茸干细胞为介于胚胎干细胞和间充质干细胞之间的一种特殊的干细胞类型。与目前所常用的骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞等干细胞相比，鹿茸干细胞更易于获取，增殖速度快，具有更大的自我更新能力，分泌大量的细胞因子和生物活性因子。因此，可以作为优秀的细胞来源，在组织器官损伤等领域进行应用。但是，目前鹿茸干细胞的稳定传代及大规模培养尚属空白，因此，建立鹿茸干细胞的稳定传代及大规模培养技术十分必要。

技术实现思路

1、本发明针对如何解决鹿茸干细胞的稳定传代和扩大规模培养问题，提供了一种鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法。

2、为实现其目的，本发明采用以下技术方案：鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，具体包括如下步骤：

3、s1、鹿茸干细胞的分离培养：鹿茸干细胞来源于健康公鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质层组织；

4、s2、鹿茸干细胞的原代培养：

5、s2.1、取出s1步骤中的鹿茸干细胞，清洗、切割；

6、s2.2、转入并在离心管中消化、离心弃上清液，加dmem原代培养液洗去消化液，离心、弃上清液，收集沉淀；

7、s2.3、取步骤s2.2中获得的沉淀，置于培养箱中先培养，当细胞达到70-80%汇合，将细胞用胰蛋白酶进行消化，收集细胞，获得原代鹿茸干细胞，冻存备用；

8、s3、鹿茸干细胞的传代培养：对步骤s2中获得的细胞进行传代培养，将能够稳定传代的细胞进行连续传代至20-50代，建立细胞株，并对每一代细胞分别进行冻存；对不能够顺利传代的细胞进行永生化处理，获得永生化的鹿茸干细胞细胞株；

9、s4、建立鹿茸干细胞大规模培养体系：

10、s4.1、在三维培养体系中细胞驯化；

11、s4.2、利用生物反应器进行3d培养。

12、优选的，所述步骤s1中，采集鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织后置于5-10倍体积的运输液中。

13、优选的，所述步骤s2.1中，使用pbs溶液反复清洗直至完全去除血污，切割成0.5-1mm3的碎块。

14、优选的，所述步骤s2.2中，所使用消化液为50-100u/mlⅰ型胶原酶溶液，在37℃条件下缓慢震荡进行消化，当组织碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化；所述原代培养液为dmem培养基中，含10-15% fbs，5-10%鹿血清，1-2%双抗。

15、优选的，所述步骤s2.3中，所述沉淀均匀涂在t25的细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入dmem原代培养液，置于37℃，5%co2饱和湿度的细胞培养箱中培养3-4h，轻轻正置培养瓶继续静置培养3-7d。

16、优选的，所述步骤s3中，使用的传代培养液：传代培养基为含5-10%fbs，含1%双抗的dmem培养液和mtesrtm1培养基组成，其中mtesrtm1培养基所占体积为培养液总体积的30-80%，mtesrtm1为间充质干细胞专用无血清培养基。

17、优选的，所述步骤s3中，永生化鹿茸干细胞株的制备方法为：

18、s3.1、构建 sv40t 抗原病毒载体：将表达 sv40t 抗原基因的逆转录病毒载体和包装载体共转染人胚肾 293 细胞系 hek293，包装出表达 sv40t 抗原的逆转录病毒；

19、s3.2、慢病毒转染：将不能稳定传代的鹿茸干细胞的原代细胞传至第2- 3 代，添加含3- 4μg/ml 聚凝胺的逆转录病毒，病毒滴度为 1×10 8tu/ml，感染 2 天后，换液并在培养液中添加 0.3- 0.4mg/ml 的潮霉素 b 筛选 14 天，形成筛选后的干细胞集落；s3.3、传代：将筛选后的干细胞集落扩增并进行连续传至 30 代以上，即得到永生化的鹿茸干细胞系，冻存备用。

20、优选的，所述步骤s3.2，使细胞密度为 3-5×10 3 /ml，0.3-0.5ml/cm2 培养面积添加逆转录病毒。

21、优选的，所述步骤s4.1中，复苏鹿茸干细胞种子细胞于传代培养基中，培养1代复壮；然后更换为3d培养基，继续培养1代后，培养方式更改为与微载体结合的三维培养。

22、进一步优选的，所述步骤s4.2中，当步骤s4.1中2d培养的细胞长至80%左右汇合时，胰酶消化，获得单细胞悬液；同时准备无菌处理的生物反应器，向其培养室投入微载体，投入密度1.5-2.5g/l，加入适当体积的3d培养基溶胀微载体至少10分钟；然后将单细胞悬液以0.5-5×107/g的比例接种入反应器，补充足够的培养基；启动反应器开始培养，day 0采用间隔式培养，即40-60rpm 5min, 0rpm 25min, 48次循环；day 1 改用恒速模式，转速为40-60rpm，确保微组织均匀悬浮；培养至day 4-5时，收获细胞；将微载体连同培养基收集到无菌容器中，静止沉降2-3min，或179×g低速离心，使微载体沉于容器底部，吸弃上清，用无菌的pbs 洗2次，加入少量胰酶消化1-3分钟，然后加入含血清培养基终止消化，然后加入等体积的1mg/ml 的3d flotrix digest裂解液，混匀，置于37℃水浴锅裂解10-30min，裂解过程中可以吹打加速微载体裂解，裂解结束后，1000rpm离心5min，收集细胞，125ml mini生物反应器可收获10亿个单细胞。

23、本发明的有益效果：

24、利用本发明中的传代培养体系，不仅可以提高鹿茸干细胞的增殖速度，而且可以防止鹿茸干细胞聚集生长，形成克隆。与普通培养基相比，鹿茸干细胞的倍增时间明显缩短。普通培养液（10%fbs，含1%双抗的dmem培养液）培养鹿茸干细胞株，倍增时间为（21h-24h），发明中的传代培养基培养鹿茸干细胞，其倍增时间为（18h-20h)。鹿茸干细胞用微载体培养常出现微载体消化不掉，收集细胞困难的问题，利用本发明中的3d培养基进行鹿茸干细胞的微载体培养，同时采用细胞消化与微载体消化结合，可以避免微载体被鹿茸干细胞包裹后，消化困难的问题，可以收获单细胞悬液。

技术特征：

1.鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，所述步骤s1中，采集鹿生茸区骨膜组织、鹿角柄骨膜组织和鹿茸间充质组织后置于5-10倍体积的运输液中。

3.根据权利要求1所述的鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，所述步骤s2.1中，使用pbs溶液反复清洗直至完全去除血污，切割成0.5-1mm3的碎块。

4.根据权利要求1所述的鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，所述步骤s2.2中，所使用消化液为50-100u/mlⅰ型胶原酶溶液，在37℃条件下缓慢震荡进行消化，当组织碎块边缘出现毛刷样毛边时，停止消化；所述原代培养液为dmem培养基中，含10-15%fbs，5-10%鹿血清，1-2%双抗。

5.根据权利要求1所述的鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，所述步骤s2.3中，所述沉淀均匀涂在t25的细胞培养瓶底部，倒置培养瓶并加入dmem原代培养液，置于37℃，5%co2饱和湿度的细胞培养箱中培养3-4h，轻轻正置培养瓶继续静置培养3-7d。

6.根据权利要求1所述的鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，所述步骤s3中，使用的传代培养液：传代培养基为含5-10%fbs，含1%双抗的dmem培养液和mtesrtm1培养基组成，其中mtesrtm1培养基所占体积为培养液总体积的30-80%，mtesrtm1为间充质干细胞专用无血清培养基。

7.根据权利要求1所述的鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，所述步骤s3.2中，使细胞密度为 3-5×10 3 /ml，0.3-0.5ml/cm2 培养面积添加逆转录病毒。

8.根据权利要求1所述的鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，所述步骤s4.1中，复苏鹿茸干细胞种子细胞于传代培养基中，培养1代复壮；然后更换为3d培养基，继续培养1代后，培养方式更改为与微载体结合的三维培养。

9.根据权利要求8所述的鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，其特征在于，所述步骤s4.2中，当步骤s4.1中2d培养的细胞长至80%左右汇合时，胰酶消化，获得单细胞悬液；同时准备无菌处理的生物反应器，向其培养室投入微载体，投入密度1.5-2.5g/l，加入适当体积的3d培养基溶胀微载体至少10分钟；然后将单细胞悬液以0.5-5×107/g的比例接种入反应器，补充足够的培养基；启动反应器开始培养，day 0 采用间隔式培养，即40-60rpm5min, 0rpm 25min, 48次循环；day 1 改用恒速模式，转速为40-60rpm，确保微组织均匀悬浮；培养至day 4-5时，收获细胞；将微载体连同培养基收集到无菌容器中，静止沉降2-3min，或179×g低速离心，使微载体沉于容器底部，吸弃上清，用无菌的pbs 洗2次，加入少量胰酶消化1-3分钟，然后加入含血清培养基终止消化，然后加入等体积的1mg/ml 的3dflotrix digest裂解液，混匀，置于37℃水浴锅裂解10-30min，裂解过程中可以吹打加速微载体裂解，裂解结束后，1000rpm离心5min，收集细胞，125ml mini生物反应器可收获10亿个单细胞。

技术总结本发明公开了鹿茸干细胞株的建立及其扩大培养方法，属于干细胞培养的技术领域。具体包括如下步骤：鹿茸干细胞的分离培养；鹿茸干细胞的原代培养；鹿茸干细胞的传代培养；建立鹿茸干细胞大规模培养体系：在三维培养体系中细胞驯化；利用生物反应器进行3D培养。利用本发明中的传代培养体系，不仅可以提高鹿茸干细胞的增殖速度，而且可以防止鹿茸干细胞聚集生长，形成克隆。与普通培养基相比，鹿茸干细胞的倍增时间明显缩短。技术研发人员：孙红梅,李勋胜,吕金朋,岳志刚,王大涛受保护的技术使用者：中国农业科学院特产研究所技术研发日：技术公布日：2024/9/9