一种解淀粉芽胞杆菌体内进化系统及其应用

本发明属于微生物基因工程，具体涉及一种解淀粉芽胞杆菌体内进化系统及其应用。

背景技术：

1、解淀粉芽胞杆菌作为一种典型的工业微生物，是生产多种生物制剂的优势细胞工厂。随着合成生物学的发展，高效的细胞工厂成为研究人员的迫切需求，建立快速、高效的合成生物学工具也成为解淀粉芽胞杆菌的研究热点。体外进化技术如易错pcr、dnashuffling可对dna序列进行高效的突变进化，被广泛应用于大肠杆菌宿主系统。但体外进化技术依赖宿主菌的高转化效率，目前解淀粉芽孢杆菌转化效率普遍较低，限制了体外进化系统在解淀粉芽胞杆菌中的应用。

2、本发明基于新型crispr单碱基编辑技术，在解淀粉芽胞杆菌中构建一种体内进化系统，该系统通过编辑碱基(c→t)实现基因表达元件的序列突变从而构建高质量rbs突变体文库，进一步利用高效碱性蛋白酶(apre)奶粉平板筛选模型获得蛋白酶发酵活性显著提升的解淀粉芽胞杆菌。

技术实现思路

1、本发明一方面保护一种解淀粉芽胞杆菌体内进化系统，所述体内进化系统是在解淀粉芽孢杆菌中融合表达cas9n蛋白和胞苷脱氨酶aid，进一步在apre基因上游整合启动子p43的rbs编辑模板xp43，还包括靶标编辑模板的sgrna表达质粒。优选地，所述aid基因序列如seq id no.1所示，所述编辑模板xp43的序列如seq id no.15所示，所述sgrna的序列如seq id no.26所示。

2、本发明另一方面保护一种含有体内进化系统的解淀粉芽胞杆菌，其构建方法包括如下步骤：

3、(1)在解淀粉芽胞杆菌hz-12中融合表达cas9n和胞苷脱氨酶aid，所述aid基因序列如seq id no.1所示，构建的工程菌株命名为解淀粉芽胞杆菌hzc9a；

4、(2)设计启动子p43的rbs编辑模板xp43，所述编辑模板xp43的序列如seq idno.15所示，进一步将所述xp43整合至解淀粉芽胞杆菌hzc9a的apre基因上游，调控apre基因的表达效果，成功整合编辑模板的工程菌株命名为hzcax；

5、(3)根据编辑模板xp43设计延长的sgrna，所述sgrna的序列如seq id no.26所示，将启动子p43、sgrna、终止子tamyl无缝连接后形成的融合基因克隆到穿梭载体，得到延长sgrna表达质粒；

6、(4)所述的sgrna表达质粒导入hzcax感受态细胞中，靶向编辑模板xp43进行碱基编辑，产生遗传多样性。

7、本发明还保护高蛋白酶活性的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，将上述含有体内进化系统的解淀粉芽胞杆菌经连续多代培养，获得突变体文库，将突变文库细胞稀释涂布在脱脂奶粉平板上，根据菌落在平板上产生透明圈的大小，挑取高碱性蛋白酶活性的解淀粉芽胞杆菌，并进行碱性蛋白酶活性检测。在本发明的具体实施例中，筛选得到一株高碱性蛋白酶活性的解淀粉芽胞杆菌hzcax-r7，其碱性蛋白酶活性为70.05u/ml，较出发菌株hzc9a提高4.70倍，其rbs序列为ggagaaaa。

8、与现有技术相比，本发明的有益效果：

9、(1)基于单碱基编辑技术，首次构建了解淀粉芽胞杆菌的体内进化系统。

10、(2)首次发现基于体内进化系统可显著提高解淀粉芽胞杆菌碱性蛋白酶活性。

技术特征：

1.一种解淀粉芽胞杆菌体内进化系统，其特征在于，所述体内进化系统包括cas9n蛋白，胞苷脱氨酶aid，rbs编辑模板以及sgrna表达质粒，所述rbs编辑模板序列如seq idno.15所示，所述sgrna的序列如seq id no.26所示。

2.含有体内进化系统的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在，包括以下步骤：

3.权利要求2所述方法构建的含有体内进化系统的解淀粉芽胞杆菌。

4.高碱性蛋白酶活性的解淀粉芽胞杆菌的构建方法，其特征在于，将权利要求3所述含有体内进化系统的解淀粉芽胞杆菌经连续多代培养，获得突变体文库，将突变文库细胞稀释涂布在脱脂奶粉平板上，根据菌落在平板上产生透明圈的大小，挑取高碱性蛋白酶活性的解淀粉芽胞杆菌，并进行碱性蛋白酶活性检测。

技术总结本发明公开了一种解淀粉芽胞杆菌体内进化系统及其应用，所述的进化系统是在解淀粉芽孢杆菌中融合表达Cas9n蛋白和胞苷脱氨酶AID，构建sgRNA单质粒系统的CBE碱基编辑器，以此为基础进一步插入含GGGGGGGG编辑区域的进化模板XP43，设计延长的sgRNA以拓宽编辑窗口，提升体内进化系统的效率。进一步以碱性蛋白酶活性为筛选目标，采用延长sgRNA启动进化程序进行多代编辑富集筛选后得到能产生梯度酶活的系列菌株，其中RBS序列为GGAGAAAA的编辑菌株HZCAX‑R7碱性蛋白酶活性最高，较出发菌株HZC9A提高4.70倍。技术研发人员：魏雪团,姜聪,韩文元,马红伟受保护的技术使用者：华中农业大学技术研发日：技术公布日：2024/9/9