一种分离瘤胃中甲烷短杆菌的方法

本发明属于微生物，具体涉及一种分离瘤胃中甲烷短杆菌的方法。

背景技术：

1、甲烷菌分为氢型，甲基型和乙基型产甲烷菌，都是严格的专性厌氧菌。但氢型的甲烷菌需要用h2和co2合成甲酸，甲酸脱氢酶由于其特有的48个铁硫蛋白维持酶活中心极低的氧化还原定位(-400mv)，而甲基型和乙基型不需要该酶参与，即可产甲烷，导致氢型的甲烷菌对氧气极为敏感性。使得分离甲烷段杆菌的技术条件极为严格，操作繁琐，成本高昂。

2、目前产甲烷菌的培养方法很多，如亨氏滚管法，厌氧箱法、厌氧袋法。这些方法都需要特定的除氧措施例如铜柱除氧，钯粒除氧等，操作步骤繁多。如：培养基的准备需要将不同的物质和组分进行分开准备，分别进行除氧，灭菌，且最后混合容易增加污染的风险。除氧方法效率低，可靠性低，例如铜柱除氧法培养的甲烷菌，氧气浓度对于严格厌氧的甲烷短杆菌并不满足，钯粒除氧法的氧浓度甚至达不到甲烷菌的厌氧条件。尤其甲烷短杆菌，该菌相对于其他甲烷菌，其生存和分离需要更低的氧化还原电位和严格厌氧条件，且该菌生长缓慢。因此，开发出一种甲烷短杆菌的分离方法具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种分离瘤胃中甲烷短杆菌的方法。

2、为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

3、所述分离瘤胃中甲烷短杆菌的方法包括如下步骤：

4、(1)配制培养基溶液：每1000ml培养基中含有kh2po4 1.2-1.6g，(nh4)2so4 0.4-0.8g，kcl 1.2-1.8g，nahco3 4.0-4.5g，l-cysteine·hcl·h2o l-半胱氨酸盐酸水0.2-0.8g，mg/ca mix钙镁溶液15-25ml，甲酸钠、醋酸钠和甲醇的混合溶液35-45ml，澄清瘤胃液130-150ml，硫化钠-半胱氨酸还原剂3-7ml，微量元素溶液0.8-1.2ml，0.1％刃天青溶液1.8-2.2ml，酵母提取物2.0-3.0g，双苷二肽6.6g，其余为蒸馏水；所述mg/ca mix钙镁溶液中钙的浓度为0.06-0.1m、镁的浓度为0.06-0.1m，所述甲酸钠、醋酸钠和甲醇的混合溶液中甲酸钠的浓度为2.8-3.2m、醋酸钠的浓度为0.8-1.2m、甲醇的浓度为0.8-1.2m，每100ml所述硫化钠-半胱氨酸还原剂中含有na2s2.3-2.7g、半胱氨酸2.3-2.7g、无水碳酸钠0.8-1.2g、其余为水，每1l微量元素溶液中含有25％ hcl 8-12ml、fecl2·4h2o 1.2-1.8g、cocl2·6h2o 180-200mg、mncl2·4h2o 80-120mg、zncl2 50-90mg、h3bo3 4-8mg、na2moo4·2h2o 30-40mg、nicl2·6h2o 20-30mg、cucl2·2h2o 1.8-2.2mg、其余为蒸馏水；

5、(2)将步骤(1)配制的培养基溶液放入丁腈厌氧瓶中磁力搅拌溶解后，抽滤，放置80-90℃的水浴锅中，持续通入二氧化碳，至培养基的颜色呈金黄色；再将培养基溶液注入添加有琼脂粉的厌氧管中，高压灭菌后置于45℃恒温的水浴中，得琼脂培养基，备用；所述琼脂粉在培养基中的质量百分比为1.5％；将步骤(1)配制的培养基溶液高压灭菌，得非琼脂培养基；

6、(3)取新鲜瘤胃液样品稀释后接种至步骤(2)所制备的琼脂培养基中，进行滚管分离，得到呈蓝绿色或绿松石色的甲烷短杆菌菌斑；挑取甲烷短杆菌菌斑接种至步骤(2)所制备的非琼脂培养基中分离纯化培养，即得纯化后的甲烷短杆菌。

7、优选地，步骤(1)中，每1000ml培养基中含有kh2po4 1.4g，(nh4)2so4 0.6g，kcl1.5g，nahco3 4.2g，l-cysteine·hcl·h2o l-半胱氨酸盐酸水0.5g，mg/ca mix钙镁溶液20ml，甲酸钠、醋酸钠和甲醇的混合溶液40ml，澄清瘤胃液140ml，硫化钠-半胱氨酸还原剂5ml，微量元素溶液1ml，0.1％刃天青溶液2ml，酵母提取物2.5g，其余为蒸馏水；所述mg/camix钙镁溶液中钙的浓度为0.08m、镁的浓度为0.08m，所述甲酸钠、醋酸钠和甲醇的混合溶液中甲酸钠的浓度为3m、醋酸钠的浓度为1m、甲醇的浓度为1m，每100ml所述硫化钠-半胱氨酸还原剂中含有na2s2.5g、半胱氨酸2.5g、无水碳酸钠1g、其余为水，每1l微量元素溶液中含有25％ hcl 10ml、fecl2·4h2o 1.5g、cocl2·6h2o 190mg、mncl2·4h2o 100mg、zncl270mg、h3bo3 6mg、na2moo4·2h2o36mg、nicl2·6h2o 24mg、cucl2·2h2o 2mg、其余为蒸馏水。

8、优选地，在进行步骤(3)接种前，向每9.5ml琼脂培养基中加入0.08-0.12ml抗生素溶液，向每9.5ml非琼脂培养基加入0.08-0.12ml抗生素溶液；每10ml所述抗生素溶液中含有青霉素钾干粉80-120万iu、硫酸链霉素干粉180-220万iu。

9、更优选地，在进行步骤(3)接种前，向每9.5ml琼脂培养基中加入0.1ml抗生素溶液，向每9.5ml非琼脂培养基加入0.1ml抗生素溶液；每10ml所述抗生素溶液中含有青霉素钾干粉100万iu、硫酸链霉素干粉200万iu。

10、优选地，在进行步骤(3)接种前，向每9.5ml琼脂培养基中加入0.08-0.12ml维生素溶液和0.08-0.12ml抗生素溶液，向每9.5ml非琼脂培养基加入0.08-0.12ml维生素溶液和0.08-0.12ml抗生素溶液；每1000ml所述维生素溶液中含有氨基苯甲酸酯35-45mg、生物素8-12mg、烟酸80-120mg、泛酸45-55mg、盐酸吡哆胺130-170mg、硫胺素80-120mg、氰钴胺45-55mg、l-6,8-硫辛酸25-35mg、核黄素25-35mg、叶酸8-12mg；每10ml所述抗生素溶液中含有青霉素钾干粉80-120万iu、硫酸链霉素干粉180-220万iu。

11、更优选地，在进行步骤(3)接种前，向每9.5ml琼脂培养基中加入0.1ml维生素溶液和0.1ml抗生素溶液，向每9.5ml非琼脂培养基加入0.1ml维生素溶液和0.1ml抗生素溶液；每1000ml所述维生素溶液中含有氨基苯甲酸酯40mg、生物素10mg、烟酸100mg、泛酸50mg、盐酸吡哆胺150mg、硫胺素100mg、氰钴胺50mg、l-6,8-硫辛酸30mg、核黄素30mg、叶酸10mg；每10ml所述抗生素溶液中含有青霉素钾干粉100万iu、硫酸链霉素干粉200万iu。

12、优选地，所述澄清瘤胃液是将获得的瘤胃液原液于12000转离心10min，取上清液，向上清液中加入mgcl2·6h2o、cacl2·2h2o，煮沸后，于12000转离心10min，即得；每200ml所述上清液中加入mgcl2·6h2o 1.0-2.0g、cacl2·2h2o 1.0-2.0g。

13、更优选地，每200ml所述上清液中加入mgcl2·6h2o 1.63g、cacl2·2h2o 1.18g。

14、本发明还提供了一种分离瘤胃中甲烷短杆菌的培养基，每1000ml所述培养基中含有kh2po4 1.2-1.6g，(nh4)2so4 0.4-0.8g，kcl 1.2-1.8g，nahco3 4.0-4.5g，l-cysteine·hcl·h2o l-半胱氨酸盐酸水0.2-0.8g，mg/ca mix钙镁溶液15-25ml，甲酸钠、醋酸钠和甲醇的混合溶液35-45ml，澄清瘤胃液130-150ml，硫化钠-半胱氨酸还原剂3-7ml，微量元素溶液0.8-1.2ml，0.1％刃天青溶液1.8-2.2ml，酵母提取物2.0-3.0g，其余为蒸馏水；所述mg/ca mix钙镁溶液中钙的浓度为0.06-0.1m、镁的浓度为0.06-0.1m，所述甲酸钠、醋酸钠和甲醇的混合溶液中甲酸钠的浓度为2.8-3.2m、醋酸钠的浓度为0.8-1.2m、甲醇的浓度为0.8-1.2m，每100ml所述硫化钠-半胱氨酸还原剂中含有na2s2.3-2.7g、半胱氨酸2.3-2.7g、无水碳酸钠0.8-1.2g、其余为水，每1l微量元素溶液中含有25％ hcl 8-12ml、fecl2·4h2o1.2-1.8g、cocl2·6h2o 180-200mg、mncl2·4h2o 80-120mg、zncl2 50-90mg、h3bo3 4-8mg、na2moo4·2h2o 30-40mg、nicl2·6h2o 20-30mg、cucl2·2h2o 1.8-2.2mg、其余为蒸馏水。

15、优选地，每1000ml所述培养基中含有kh2po4 1.4g，(nh4)2so4 0.6g，kcl 1.5g，nahco3 4.2g，l-cysteine·hcl·h2o l-半胱氨酸盐酸水0.5g，mg/ca mix钙镁溶液20ml，甲酸钠、醋酸钠和甲醇的混合溶液40ml，澄清瘤胃液140ml，硫化钠-半胱氨酸还原剂5ml，微量元素溶液1ml，0.1％刃天青溶液2ml，酵母提取物2.5g，其余为蒸馏水；所述mg/ca mix钙镁溶液中钙的浓度为0.08m、镁的浓度为0.08m，所述甲酸钠、醋酸钠和甲醇的混合溶液中甲酸钠的浓度为3m、醋酸钠的浓度为1m、甲醇的浓度为1m，每100ml所述硫化钠-半胱氨酸还原剂中含有na2s2.5g、半胱氨酸2.5g、无水碳酸钠1g、其余为水，每1l微量元素溶液中含有25％hcl 10ml、fecl2·4h2o 1.5g、cocl2·6h2o190mg、mncl2·4h2o 100mg、zncl2 70mg、h3bo36mg、na2moo4·2h2o 36mg、nicl2·6h2o 24mg、cucl2·2h2o 2mg、其余为蒸馏水。

16、优选地，所述甲烷短杆菌的培养基为甲烷短杆菌的培养基。

17、本发明通过反复调整培养基的配方和操作方法，可进行一锅法制备培养基，不用反复将各成分准备液进行高温灭菌和除氧。经过多次分离验证后，可在两个星期即可获得20-40株甚至更多株的甲烷短杆菌，进行二次分离后纯度可达99％。该方法可实现快速二次分离，可操作性强，具有效率高，重复性高，成本低等特点。实现反刍动物瘤胃内的甲烷短杆菌的简易且快速分离、纯化、扩繁。