用于异种移植的基因修饰

本文提供了不表达内源性猪cd47或sirpa但表达人或人源化cd47和人或人源化sirpa的重组小型猪。在某些实施方案中，人或人源化cd47和人或人源化sirpa在本文提供的重组小型猪中的表达受与内源性猪cd47和sirpa相同的调控元件控制。还提供了来源于这种重组小型猪的细胞、组织和器官。此外，本文提供了在有或没有来自这种重组小型猪的第二供体的骨髓的情况下移植来自这种重组小型猪的第一供体的移植物的方法。

背景技术：

1、目前同种异体供体的严重短缺限制了进行器官移植的数量。可通过使用来自其他物种的器官(异种移植物)来纠正这种供需差异。鉴于使用非人灵长类动物存在伦理问题和不切实际性，猪被认为是人类最适合的供体物种。除了器官大小和生理学与人类相似之外，猪能够快速繁殖和近亲繁殖，使得它们特别适合进行基因修饰，从而可以提高它们作为人类移植物供体的能力。参见例如，sachs(1994),path.biol.42:217-219和piedrahita等人(2004),am.j.transplant,4suppl.6:43-50。

2、尽管移植联合非特异性免疫抑制疗法可以使早期移植物接受率较高，但临床器官移植成功的主要限制是晚期移植物丢失，这主要是由于对移植的慢性排斥造成的。因此免疫耐受是移植的主要目标，并且对于成功的临床异种移植来说甚至更为重要，因为防止异种移植物排斥所需的终生免疫抑制水平可能毒性太大而难以接受。另外，尚未鉴定出任何可以可靠表明患者是否已实现免疫耐受的标志物，导致缺乏可以作为免疫抑制停药依据的实验室参数。

3、因此，异种移植的目标包括实现免疫耐受。这可以通过异种胸腺移植或通过优化起源于供体动物的混合嵌合细胞在移植到异种受者后的耐久性以及维持供体动物的健康和生存力来实现。

4、混合嵌合可以在受者的t细胞、b细胞和自然杀伤(nk)细胞水平上诱导对供体的耐受。参见例如，griesemer等人(2014),immunol.rev.258:241-258；sachs等人(2014),coldspring harb.perspect.med.4:a015529。

5、cd47也称为整联蛋白相关蛋白(iap)，是一种广泛表达的50-kda细胞表面糖蛋白并且充当信号调节蛋白sirpα(也称为cd172a和shps-1，其基因是sirpa)的配体。参见例如，brown(2002),curr.opin.cell.biol.,14:603-7；和brown和frazier(2001),trends cellbiol.,111130-5。cd47和sirpα构成细胞-细胞通讯系统，在包括细胞迁移、b细胞粘附和t细胞激活在内的多种细胞过程中发挥重要作用。参见例如，liu等人(2002),j.biol.chem.277:10028；motegi等人(2003),embo 122:2634；yoshida等人(2002),j.lmmunol.168:3213；以及latour等人(2001),j.lmmunol.167:2547。另外，cd47-sirpα系统与巨噬细胞的吞噬作用的负调节有关。一些细胞类型(即，红细胞、血小板或白细胞)的表面上的cd47会抑制巨噬细胞的吞噬作用。cd47-sirpα相互作用在抑制吞噬作用中的作用已经通过以下观察结果得到证实：原代野生型小鼠巨噬细胞快速吞噬从cd47缺陷型小鼠获得的未经调理的红细胞(rbc)，但不吞噬来自野生型小鼠的未经调理的红细胞。参见例如，oldenborg等人(2000),science 288:2051。还报道了cd47通过其受体sirpα抑制fcγ和补体受体介导的吞噬作用。参见例如，oldenborg等人(2001),j.exp.med.193:855。cd47ko细胞在输注到同基因野生型(wt)小鼠中后被巨噬细胞强烈排斥，证明cd47向巨噬细胞提供“别吃我”信号。参见例如，oldenborg pa等人(2000),science,288:2051-4；以及wang等人(2007),proc natl acad sci u s a.104:13744。使用猪作为移植来源的异种移植具有解决人类器官供体(临床移植中的主要限制因素)严重短缺的潜力。参见例如，yang等人(2007),nature reviews immunology.7:519-31。巨噬细胞对异种细胞的强烈排斥(参见例如，abe(2002),the journal of immunology 168:621)主要由供体cd47与受者sirpα之间缺乏功能相互作用引起(参见例如，wang等人(2007),blood；109:836-42；ide等人(2007),proc natl acad sci usa 104:5062-6；以及navarro-alvarez(2014),celltransplantation,23:345-54)，从而导致人cd47转基因猪的出现(参见例如，tena等人(2017),transplantation 101:316-21；以及nomura等人(2020),xenotransplantation2020；27:e12549)。除了巨噬细胞之外，dc的亚群也表达sirpα(参见例如，wang等人(2007),proc natl acad sci u s a.104:13744-9；以及guilliams等人(2016),immunity.45:669-84)。cd47-sirpα信号传导还会抑制dc激活及其引发t细胞的能力，并且在通过供体特异性输注(dst)或肝细胞移植诱导t细胞耐受中发挥重要作用。参见例如，wang等人(2007),procnatl acad sci u s a.104:13744-9；wang等人(2014),cell transplantation 23:355-63；以及zhang等人(2016),sci rep.6:26839。因此，对于产生安全且耐受良好的用于异种移植的供体材料(例如，器官、组织、细胞等)存在尚未满足的需求，这些供体材料不会经由cd47-sirpα信号传导发生排斥。

技术实现思路

1、在一个方面，本文提供了一种重组小型猪，其中该重组小型猪包含：(a)(i)缺失或功能失活的编码猪cd47的内源性基因，其中编码猪cd47的内源性基因的表达受猪cd47调控元件调控；以及(ii)插入在猪基因组内的编码人cd47的转基因，其中编码人cd47的转基因的表达受猪cd47调控元件调控；以及(b)(i)缺失或功能失活的编码猪sirpα的内源性基因，其中编码猪sirpα的内源性基因的表达受猪sirpa调控元件调控；以及(ii)插入在猪基因组内的编码人sirpα的转基因，其中编码人sirpα的转基因的表达受猪sirpa调控元件调控。

2、在一些实施方案中，小型猪是α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。

3、在一些实施方案中，α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是主要组织相容性复合物(mhc)-近亲繁殖小型猪。

4、在一些实施方案中，人cd47包含seq id no.1、2或3。在一些实施方案中，人sirpa包含seq id no.4或5。

5、在一些实施方案中，编码人sirpα和人cd47的转基因通过同源重组插入在小型猪的基因组中。在一些实施方案中，编码人sirpα和人cd47的转基因通过非同源定向末端连接插入在猪基因组中。在一些实施方案中，编码人sirpα和人cd47的转基因通过重组酶介导的盒交换插入在猪基因组中。在一些实施方案中，编码人sirpα和人cd47的转基因通过位点特异性核酸酶插入在猪基因组中。在一些实施方案中，位点特异性核酸酶选自由锌指、zfn二聚体、zfnickase、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)和crispr/cas9组成的组。

6、在一些实施方案中，编码人cd47的转基因的表达受ncbi基因id:397042的猪cd47调控元件调控。根据权利要求1所述的重组小型猪，其中编码人sirpα的转基因的表达受ncbi基因id:494566的猪sirpa调控元件调控。

7、在一些实施方案中，人cd47蛋白表达基本上类似于内源性猪cd47的表达模式，如通过免疫组织化学所测定的。在一些实施方案中，人sirpα蛋白表达基本上类似于内源性猪sirpα的表达模式，如通过免疫组织化学所测定的。

8、在另一方面，本文提供了一种重组小型猪，该重组小型猪包含人源化cd47基因；和/或(b)人源化sirpa基因。在一些实施方案中，重组小型猪包含人源化cd47基因。在一些实施方案中，重组小型猪包含人源化sirpa基因。在一些实施方案中，重组小型猪包含人源化cd47基因和人源化sirpa基因。在一些实施方案中，人源化cd47基因包括包含人cd47的外显子2的猪cd47基因。

9、在另一方面，本文提供了一种细胞，该细胞来源于本文提供的重组小型猪。

10、在另一方面，本文提供了一种卵母细胞，该卵母细胞来源于本文提供的重组小型猪。

11、在另一方面，本文提供了一种精子，该精子来源于本文提供的重组小型猪。

12、在另一方面，本文提供了一种组织，该组织来源于本文提供的重组小型猪。

13、在另一方面，本文提供了一种器官，该器官来源于本文提供的重组小型猪。

14、在另一方面，本文提供了一种将来自第一重组小型猪的移植物移植到灵长类动物中的方法，其中该方法包括：(a)获得来自本文提供的第一重组小型猪的移植物；以及(b)将该移植物移植到灵长类动物中。在一些实施方案中，灵长类动物是人。在一些实施方案中，移植物包括细胞、组织或器官。在一些实施方案中，器官选自由心脏、肾、胰岛、肝脏、胰腺、肺、肠、皮肤、气管和角膜或它们的组合组成的组。

15、在一些实施方案中，该方法还包括获得来自本文提供的第二重组小型猪的骨髓，以及将该骨髓移植到同一灵长类动物中。在一些实施方案中，在移植来自第一重组猪的移植物之前至少28天移植骨髓。

16、在一些实施方案中，第一重组小型猪和第二重组小型猪是同一重组猪。在一些实施方案中，第一重组小型猪和第二重组小型猪来自小型猪的高度近亲繁殖畜群。在一些实施方案中，第一重组小型猪和第二重组小型猪是基因匹配的小型猪。在一些实施方案中，第一重组小型猪和第二重组小型猪是mhc匹配的。

17、在一些实施方案中，来自第一重组小型猪的移植物在受者中存活至少6个月、1年、5年、10年、15年或20年。在一些实施方案中，来自第一重组小型猪的移植物在受者中作用至少6个月、1年、5年、10年、15年或20年。

18、在一些实施方案中，受者所需的免疫抑制疗法减少90％、80％、70％、60％或50％。