SERPINA调节组合物和方法与流程

背景技术：

1、在没有专门的蛋白质来促进插入事件的情况下，目的核酸整合到基因组中的频率较低且位点特异性极低。一些现有的方法，如crispr/cas9，更适合依赖宿主修复途径的小型编辑，并且在整合较长序列时效率较低。其他现有的方法如cre/loxp需要第一步先将loxp位点插入基因组中，然后第二步将目的序列插入loxp位点中。本领域需要改善的组合物(例如，蛋白质和核酸)和方法，以在基因组中插入、改变、或缺失目的序列。

2、aatd的特点是aat的循环水平低。aat主要在肝细胞中产生并分泌到血液中，但它也由其他细胞类型产生，包括肺上皮细胞和某些白细胞。aat抑制炎症细胞分泌的几种丝氨酸蛋白酶(最显著的是中性粒细胞弹性蛋白酶[ne]、蛋白酶3和组织蛋白酶g)，从而保护器官(如肺)免受蛋白酶诱导的损害，尤其是在炎症期间。

3、aat最常见的两种临床变体是e264v(pis)和e342k(piz)等位基因。临床单核苷酸变体e342k(piz)导致aat蛋白结构不稳定和/或无活性，从而导致肝脏毒性和肺部无活性。遗传方式为常染色体共显性。超过一半的aatd患者至少携带一个突变e342k拷贝。

4、最常见与aatd相关的突变涉及编码aat蛋白的serpina1基因中谷氨酸取代赖氨酸(e342k)。e342k突变位于aat蛋白的β片层和反应中心环(rcl)之间的铰链处，并导致环-片二聚体形成，该二聚体随后可以延伸形成长链环-片聚合物，这些聚合物在生物合成期间在肝细胞的粗面内质网(rer)内聚集aat-z蛋白。此突变(称为z突变或z等位基因)导致翻译蛋白质错误折叠，因此不会分泌到血液中。因此，z等位基因纯合(pizz)个体的循环aat水平显著降低；只有大约15％的突变z-aat蛋白正确折叠并被细胞分泌。z突变的另一个后果是与野生型蛋白相比，分泌的z-aat活性降低，该活性为正常抗蛋白酶活性的40％至80％(american thoracic society/european respiratory society[美国胸科协会/欧洲呼吸协会]，am j respir crit care med.[美国呼吸与重症监护医学杂志]2003；168(7)：818-900；和ogushi等人j clin invest.[临床研究杂志]1987；80(5)：1366-74)。

5、有两种疾病表型与pizz基因型相关。肝细胞内聚合z-aat蛋白的积累会导致功能获得性细胞毒性，从而可导致细胞应激、炎症、纤维化、肝硬化、肝细胞癌(hcc)和新生儿肝病(12％的患者)。这种积累可能会自行缓解，但对少数儿童来说可能是致命的。功能丧失表型是由于aat的全身水平降低导致蛋白酶对下呼吸道结缔组织的消化增加。结缔组织和肺泡内壁的过量蛋白酶消化会降低肺弹性和肺功能，导致肺气肿，即慢性阻塞性肺病(copd)的标志。这种影响在pizz个体中非常严重，并且典型地在中年时期显现，导致生活质量下降和寿命缩短(平均68岁)(tanash等人int j chron obstruct pulm dis.[国际慢性阻塞性肺疾病杂志]2016；11：1663-9)。该影响对吸烟的pizz个体来说更明显，导致寿命进一步缩短(58岁)。piitulainen和tanash，copd 2015；12(1)：36-41。pizz个体占临床相关aatd肺病患者的大多数。

6、aatd的较轻微形式与其中z等位基因与s等位基因组合的sz基因型有关。s等位基因与循环aat水平略有降低有关，但不会引起肝细胞的细胞毒性。结果是临床上显著的肺病，但没有肝病。fregonese和stolk，orphanet j rare dis.[罕见病孤儿杂志]2008；33：16。与zz基因型一样，sz基因型受试者的循环aat缺乏会导致蛋白酶活性不受调节，从而随着时间的推移降解肺组织，并可能导致肺气肿(尤其是在吸烟者中)。

7、虽然存在aatd的有限治疗选择，但目前尚无治愈方法。一小部分新生儿患者和晚期肝病患者接受肝移植。对于患有严重肺病或表现出发展严重肺病的迹象的aat缺乏个体，目前的标准护理是增强疗法或蛋白质替代疗法。增强疗法包括施用从汇集的供体血浆中纯化的人aat蛋白浓缩物来增强缺失的aat。此治疗包括每周输注从健康血液供体纯化的aat蛋白。尽管已经证明血浆蛋白的输注改善存活率或减缓肺气肿进展的速度，但在具有挑战性的条件下(例如活动性肺部感染)，增强疗法通常是不够的。增强疗法也无法恢复患者aat的正常生理调节，且疗效难以证明。此外，增强疗法无法解决由z等位基因的毒性功能获得引起的肝病。因此，需要新的、更有效的aatd治疗方法。

技术实现思路

1、本披露涉及用于体内或体外改变宿主细胞、组织或受试者中一个或多个位置处的基因组的新型组合物、系统和方法。本披露提供了能够调节(例如，插入、改变或缺失目的序列)α-1抗胰蛋白酶(aat)活性的基因修饰系统，以及通过施用一种或多种这样的系统以改变单个核苷酸处的基因组序列来纠正导致α-1抗胰蛋白酶缺乏症的serpina1piz突变来治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症(aatd)的方法。

2、一方面，本披露涉及一种用于修饰dna以纠正引起aatd的人serpina1基因突变的系统，该系统包含(a)编码能够靶向引发的逆转录的基因修饰多肽的核酸，该多肽包含(i)逆转录酶结构域和(ii)结合dna并具有核酸内切酶活性的cas9切口酶；和(b)模板rna，其包含(i)与人serpina1基因的第一部分互补的grna间隔子，(ii)结合该多肽的grna支架，(iii)包含突变区以纠正突变的异源对象序列，以及(iv)引物结合位点(pbs)序列，其包含与该模板rna的3′端处的靶dna链具有100％同源性的至少3、4、5、6、7或8个碱基。serpina1基因可能包含e342k突变(也称为piz突变)。模板rna序列可以包含本文所述，例如表1、3、4、5、6a、6b、x2、x3、x3a、x5、或xx中的序列。

3、grna间隔子可以包含与模板rna的5’端处的靶dna具有100％同一性的至少15个碱基。模板rna可以进一步包含pbs序列，该pbs序列包含与靶dna链具有至少80％同源性的至少5个碱基。模板rna可以包含一个或多个化学修饰。

4、基因修饰多肽的结构域可以通过肽接头连接。该多肽可包含一个或多个肽接头。基因修饰多肽可以进一步包含核定位信号。该多肽可包含多于一个核定位信号，例如，多个相邻的核定位信号或在该多肽的不同区域中的一个或多个核定位信号，例如，在该多肽的n末端中的一个或多个核定位信号以及在该多肽的c末端中的一个或多个核定位信号。编码基因修饰多肽的核酸可以编码一个或多个内含肽结构域。

5、将该系统引入靶细胞可以导致插入至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、500或1000个碱基对的外源dna。将该系统引入靶细胞可导致缺失，其中该缺失是该插入上游或下游的基因组dna的少于2、3、4、5、10、50或100个碱基对。将该系统引入靶细胞可导致取代，例如1、2或3个核苷酸(例如连续核苷酸)的取代。

6、异源对象序列可以是至少5、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600或700个碱基对。

7、一方面，本披露涉及一种药物组合物，其包含上述系统和药学上可接受的赋形剂或载剂，其中该药学上可接受的赋形剂或载剂选自由以下组成的组：质粒载体、病毒载体、囊泡和脂质纳米颗粒。一方面，本披露涉及一种药物组合物，其包含上述系统和多种药学上可接受的赋形剂或载剂，其中该药学上可接受的赋形剂或载剂选自由以下组成的组：质粒载体、病毒载体、囊泡和脂质纳米颗粒，例如，其中上述系统由两种不同的赋形剂或载剂递送，例如两种脂质纳米颗粒、两种病毒载体、或一种脂质纳米颗粒和一种病毒载体。该病毒载体可以是腺相关病毒(aav)。

8、一方面，本披露涉及一种宿主细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞)，其包含上述系统。

9、一方面，本披露涉及一种纠正细胞、组织或受试者中人serpina1基因突变的方法，该方法包括向该细胞、组织或受试者施用上述系统，其中任选地，突变serpina1基因的纠正包括k342e的氨基酸取代(逆转致病性取代e342k)。该系统可以体内、体外、离体或原位引入。(a)的核酸可以整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，(a)的核酸未整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，异源对象序列仅插入宿主细胞基因组中的一个靶位点。异源对象序列可以插入宿主细胞基因组中的两个或更多个靶位点，例如，插入两个同源染色体中的相同对应位点，或相同或不同染色体上的两个不同位点。异源对象序列可以编码哺乳动物多肽或其片段或变体。该系统的组分可以在1、2、3、4或更多个不同的核酸分子上递送。可以通过电穿孔或通过使用选自质粒载体、病毒载体、囊泡和脂质纳米颗粒的至少一种媒介物将该系统引入宿主细胞中。

10、这些组合物或方法的特征可包括以下列举的实施例中的一个或多个。

11、列举的实施例

12、1.一种模板rna，其例如从5’至3’包含：

13、(i)与人serpina1基因的第一部分互补的grna间隔子，其中该grna间隔子具有包含表1中grna间隔子序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该grna间隔子的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸(例如，包含与这些核心核苷酸相邻的一个或多个侧翼核苷酸)，或者其中该grna间隔子具有表6a、6b、x2、x3、x3a、x5、或xx中grna间隔子的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列；

14、(ii)结合基因修饰多肽(例如，结合该基因修饰多肽的cas结构域)的grna支架，

15、(iii)异源对象序列，其包含突变区，以将突变引入该人serpina1基因的第二部分中(例如，以纠正该第二部分中的突变)(其中任选地该异源对象序列从5’至3’包含编辑后同源区、突变区和编辑前同源区)，以及

16、(iv)引物结合位点(pbs)序列，其包含与该人serpina1基因的第三部分具有100％同一性的至少3、4、5、6、7或8个碱基。

17、2.如实施例1所述的模板rna，其中该异源对象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该rt模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或其中该异源对象序列包含表6a或6b中rt模板序列的序列。

18、3.如实施例1所述的模板rna，其中该异源对象序列包含对应于该grna间隔子序列的表3中的rt模板序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该rt模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸(例如，包含与这些核心核苷酸相邻的一个或多个侧翼核苷酸)，或其中该异源对象序列包含表6a或6b中rt模板序列的序列。

19、4.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其中该异源对象序列具有来自表x3或x3a中所示的模板rna的异源对象序列的序列，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列，或相对于其具有1、2、或3个取代的序列。

20、5.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其中该异源对象序列的长度为6-16个核苷酸(例如，6、8、10、12、14、15、或16个核苷酸)。

21、6.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其中该pbs序列具有包含来自表3中与该rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸(例如，包含与这些核心核苷酸相邻的一个或多个侧翼核苷酸)。

22、7.如实施例1-5中任一项所述的模板rna，其中该pbs序列具有包含对应于该rt模板序列或相对于其具有1、2或3个取代的序列、该grna间隔子序列或两者的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸，或其中该pbs序列具有包含对应于该rt模板序列、该grna间隔子序列或两者的表6a或6b中的pbs序列或相对于其具有1、2或3个取代的序列的序列。

23、8.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其中该pbs序列具有来自表x3或x3a中所示的模板rna的pbs的序列，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列，或相对于其具有1、2、或3个取代的序列。

24、9.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其中该pbs序列的长度为8-12个核苷酸(例如，8、9、10、11、或12个核苷酸)。

25、10.如实施例1-9中任一项所述的模板rna，其中该grna支架包含表12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

26、11.如实施例1-9中任一项所述的模板rna，其中该grna支架包含对应于该rt模板序列、该grna间隔子序列、或两者的表12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

27、12.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其中该grna支架具有来自表x2、x3、或x3a中所示的模板rna的grna支架的序列，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列。

28、13.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其包含表x2、x3、或x3a中所示的模板rna的序列，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％同一性的序列。

29、14.一种模板rna，其例如从5’至3’包含：

30、(i)与人serpina1基因的第一部分互补的grna间隔子，

31、(ii)结合基因修饰多肽(例如，结合该基因修饰多肽的cas结构域)的grna支架，

32、(iii)异源对象序列，其包含突变区，以将突变引入该人serpina1基因的第二部分(例如，以纠正该第二部分中的突变)，其中该异源对象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2、或3个取代的序列，并且任选地包含从该rt模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或其中该异源对象序列包含表6a或6b的rt模板序列；以及

33、(iv)pbs序列，其包含与该人serpina1基因的第三部分具有100％同一性的至少3、4、5、6、7或8个碱基。

34、15.如实施例14所述的模板rna，其中该grna间隔子包含表1中grna间隔子序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该grna间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或者其中该grna间隔子包含表6a或6b中的grna间隔子序列。

35、16.如实施例14所述的模板rna，其中该异源对象序列包含对应于该rt模板序列的表1中的grna间隔子序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该grna间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，或其中该异源对象序列包含表6a或6b的grna间隔子序列的核苷酸。

36、17.如实施例14-16中任一项所述的模板rna，其中该pbs序列具有包含来自表3中与该rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸。

37、18.如实施例14-17中任一项所述的模板rna，其中该pbs序列具有包含对应于该rt模板序列或相对于其具有1、2或3个取代的序列、该grna间隔子序列或两者的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸，或其中该pbs序列具有包含对应于该rt模板序列、该grna间隔子序列或两者的表6a或6b中pbs序列的序列。

38、19.如实施例14-18中任一项所述的模板rna，其中该grna支架包含表6a或12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

39、20.如实施例14-18中任一项所述的模板rna，其中该grna支架包含对应于该rt模板序列、该grna间隔子序列、或两者的表6a或12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

40、21.一种用于修饰dna的基因修饰系统，其包含：

41、(a)第一rna，其从5’至3包含：(i)与人serpina1基因的第一部分互补的指导rna序列，其中该指导rna序列具有包含表1中间隔子序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该指导rna序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸；以及(ii)结合基因修饰多肽(例如，结合该基因修饰多肽的cas结构域)的序列(例如，支架区)，以及

42、(b)第二rna，其包含：(iii)异源对象序列，其包含核苷酸取代以将突变引入该人serpina1基因的第二部分(其中任选地，该异源对象序列从5’至3’包含编辑后同源区、突变区和编辑前同源区)；(iv)引物区，其包含与该人serpina1基因的第三部分具有100％同一性的至少5、6、7或8个碱基；以及(v)结合基因修饰蛋白的rrs(rna结合蛋白识别序列)。

43、22.如实施例21所述的基因修饰系统，其中该异源对象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该rt模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。

44、23.如实施例21所述的基因修饰系统，其中该异源对象序列包含对应于该grna间隔子序列的表3中的rt模板序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该rt模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。

45、24.如实施例21-23中任一项所述的基因修饰系统，其中该pbs序列具有包含来自表3中与该rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸。

46、25.如实施例21-23中任一项所述的基因修饰系统，其中该pbs序列具有包含对应于该rt模板序列或相对于其具有1、2或3个取代的序列、该grna间隔子序列或两者的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸。

47、26.如实施例21-25中任一项所述的基因修饰系统，其中该grna支架包含表12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

48、27.如实施例21-25中任一项所述的基因修饰系统，其中该grna支架包含对应于该rt模板序列、该grna间隔子序列、或两者的表12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

49、28.一种用于修饰dna的基因修饰系统，其包含：

50、(a)第一rna，其从5’至3包含：(i)与人serpina1基因的第一部分互补的指导rna序列，和(ii)结合基因修饰多肽(例如，结合该基因修饰多肽的cas结构域)的序列(例如，支架区)，以及

51、(b)第二rna，其包含：(iii)异源对象序列，其包含核苷酸取代，以将突变引入该人serpina1基因的第二部分，其中该异源对象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该rt模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，和(iv)引物区，其包含与该人serpina1基因的第三部分具有100％同源性的至少5、6、7或8个碱基，以及(v)结合基因修饰蛋白的rrs(rna结合蛋白识别序列)。

52、29.如实施例28所述的基因修饰系统，其中该grna间隔子包含表1中grna间隔子序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该grna间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。

53、30.如实施例28所述的基因修饰系统，其中该异源对象序列包含对应于该rt模板序列的表1中的grna间隔子序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该grna间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。

54、31.如实施例28-30中任一项所述的基因修饰系统，其中该pbs序列具有包含来自表3中与该rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸。

55、32.如实施例28-30中任一项所述的基因修饰系统，其中该pbs序列具有对应于该rt模板序列、该grna间隔子序列、或两者的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸。

56、33.如实施例28-32中任一项所述的基因修饰系统，其中该grna支架包含表12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

57、34.如实施例28-32中任一项所述的基因修饰系统，其中该grna支架包含对应于该rt模板序列、该grna间隔子序列、或两者的表12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

58、35.一种grna，其包含：(i)与人serpina1基因的第一部分互补的grna间隔子序列，其中该grna间隔子具有包含表1、表2、或表4中grna间隔子序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该grna间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸；以及(ii)grna支架。

59、36.如实施例35所述的grna，其中该grna支架包含表12中grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

60、37.如实施例35所述的grna，其中该grna支架包含对应于该grna间隔子序列的表12中的grna支架的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

61、38.一种模板rna，其包含：(iii)异源对象序列，其包含突变区，以将突变引入人serpina1基因的第二部分，其中该异源对象序列包含表3中rt模板序列的核心核苷酸，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该rt模板序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸，以及(iv)pbs序列，其包含与该人serpina1基因的第三部分具有100％同源性的至少5、6、7或8个碱基。

62、39.如实施例38所述的模板rna，其中该pbs序列具有包含来自表3中与该rt模板序列同一行的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸。

63、40.如实施例38所述的模板rna，其中该pbs序列具有包含对应于该rt模板序列的表3中的pbs序列的核心核苷酸的序列，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且任选地包含从该pbs序列的侧翼核苷酸的5’端开始的一个或多个连续核苷酸。

64、41.如实施例1-20或38-40中任一项所述的模板rna、如实施例21-34中任一项所述的基因修饰系统、或如实施例35-37中任一项所述的grna，其中由该系统引入的突变是该serpina1基因的k342e突变(例如，以纠正致病性e342k突变)。

65、42.如实施例1-20或38-41中任一项所述的模板rna，或如实施例21-34或41中任一项所述的基因修饰系统，其中该编辑前序列长度包含约1个核苷酸至约35个核苷酸(例如，包含约1-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30或30-35个核苷酸)。

66、43.如实施例1-20或38-42中任一项所述的模板rna，或如实施例21-34、41或42中任一项所述的基因修饰系统，其中该突变区包含单核苷酸。

67、44.如实施例1-20或38-42中任一项所述的模板rna，或如实施例21-34、41、或42中任一项所述的基因修饰系统，其中该突变区长度为至少两个核苷酸。

68、45.如实施例1-20、38-42或44中任一项所述的模板rna，或如实施例21-34、41、42或44中任一项所述的基因修饰系统，其中该突变区长度为高达32个(例如，高达5、10、15、20、25、30或32个)核苷酸，并且相对于该人serpina1基因的第二部分包含一个、两个或三个序列差异。

69、46.如实施例1-20、38-42、44或45中任一项所述的模板rna，或如实施例21-34、41、42、44或45中任一项所述的基因修饰系统，其中该突变区相对于该人serpina1基因的第二部分包含两个序列差异。

70、47.如实施例1-20、38-42或44-46中任一项所述的模板rna，或如实施例21-34、41、42或44-46中任一项所述的基因修饰系统，其中该突变区包含设计用于纠正该serpina1基因中的致病性突变的第一区(例如，第一核苷酸)和设计用于灭活pam序列(例如，如表5中所述的“pam-杀灭”突变)的第二区(例如，第二核苷酸)。

71、48.如实施例1-20、38-46中任一项所述的模板rna，或如实施例21-34或41-46中任一项所述的基因修饰系统，其中该突变区与该人serpina1基因的对应部分包含小于80％、70％、60％、50％、40％或30％同一性。

72、49.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其中该模板rna包含一种或多种沉默突变(例如，沉默取代)，例如，如表7b中所例示的。

73、50.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其中该突变区包含设计用于纠正该serpina1基因中的致病性突变的第一区和设计用于引入沉默取代的第二区。

74、51.如前述实施例中任一项所述的模板rna，其包含一个或多个化学修饰的核苷酸。

75、52.一种基因修饰系统，其包含：

76、如实施例1-20、38-42中任一项所述的模板rna，或如实施例21-34或41-46中任一项所述的系统，以及

77、基因修饰多肽或编码该基因修饰多肽的核酸(例如rna)。

78、53.如实施例52所述的基因修饰系统，其中该基因修饰多肽包含：

79、逆转录酶(rt)结构域(例如，来自逆转录病毒的rt结构域，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的多肽结构域)；和

80、与靶dna分子结合且与该rt结构域异源的cas结构域(例如，cas9结构域)；以及

81、任选地，布置在该rt结构域和该cas结构域之间的接头。

82、54.如实施例53所述的基因修饰系统，其中该rt结构域包含：

83、(a)表6的rt结构域；或

84、(b)来自以下的rt结构域：鼠白血病病毒(mmlv)、猪内源逆转录病毒(perv)、禽网状内皮组织增生病病毒(avire)、猫白血病病毒(flv)、猿泡沫病毒(sfv)(例如sfv3l)、牛白血病病毒(blv)、梅森-菲合猴病毒(mpmv)、人泡沫病毒(hfv)、或牛泡沫/合胞病毒(bfv/bsv)。

85、55.如实施例53或54所述的基因修饰系统，其中该cas结构域包含表x1、xx、或x5的cas结构域，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

86、56.如实施例53-55中任一项所述的基因修饰系统，其中该间隔子包含表xx的间隔子，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且该cas结构域包含表xx中同一行的cas结构域或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

87、57.如实施例53-56中任一项所述的基因修饰系统，其中该间隔子包含表xx的间隔子，并且该cas结构域包含表xx中同一行的cas结构域。

88、58.如实施例53-57中任一项所述的基因修饰系统，其中该间隔子包含表x5的间隔子，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且该cas结构域包含表x5中同一行的cas结构域或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

89、59.如实施例53-58中任一项所述的基因修饰系统，其中该间隔子包含表x5的间隔子，并且该cas结构域包含表x5中同一行的cas结构域。

90、60.如实施例53-59中任一项所述的基因修饰系统，其中该间隔子包含表6a的间隔子，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且该cas结构域包含表6a中同一行的cas结构域或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

91、61.如实施例53-60中任一项所述的基因修饰系统，其中该间隔子包含表6a的间隔子，并且该cas结构域包含表6a中同一行的cas结构域。

92、62.如实施例53-51中任一项所述的基因修饰系统，其中该间隔子包含表6b的间隔子，或相对于其具有1、2或3个取代的序列，并且该cas结构域包含表6b中同一行的cas结构域或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％氨基酸序列同一性的序列。

93、63.如实施例53-62中任一项所述的基因修饰系统，其中该间隔子包含表6b的间隔子，并且该cas结构域包含表6b中同一行的cas结构域。

94、64.如实施例53-63中任一项所述的基因修饰系统，其中该cas结构域包含表7或表8的cas结构域。

95、65.如实施例53-64中任一项所述的基因修饰系统，其中该cas结构域：

96、(a)是cas9结构域；

97、(b)是spcas9结构域、blatcas9结构域、nme2cas9结构域、pnpcas9结构域、saucas9结构域、saucas9-kkh结构域、sauricas9结构域、sauricas9-kkh结构域、scacas9-sc++-结构域、spycas9结构域、spycas9-ng结构域、spycas9-spry结构域或st1cas9结构域；和/或

98、(c)是包含n670a突变、n611a突变、n605a突变、n580a突变、n588a突变、n872a突变、n863突变、n622a突变或h840a突变的cas9结构域。

99、66.如实施例65所述的基因修饰系统，其中该cas9结构域结合表7或表12中列出的pam序列。

100、67.如实施例66所述的基因修饰系统，其中该人serpina1基因的第二部分与该cas结构域识别的pam重叠，例如，其中该人serpina1基因的第二部分在该pam内或其中该pam在该人serpina1基因的第二部分内。

101、68.如实施例53-67中任一项所述的基因修饰系统，其中该grna间隔子是根据表1的grna间隔子，并且该cas结构域包含表1同一行中列出的cas结构域，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

102、69.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统，其中该模板rna包含表6a或6b中模板rna序列的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

103、70.如实施例53-69中任一项所述的基因修饰系统，其中：

104、(a)该模板rna包含表3中模板rna序列的序列；

105、(b)该cas结构域包含表7或表8的cas结构域；

106、(c)该接头包含表10的接头序列(例如seq id no：5217、5106、5190和5218中任一个的接头序列)；并且

107、(d)该基因修饰多肽包含来自表11的一个或两个nls序列(例如seq id no：5245、5290、5323、5330、5349、5350、5351和4001中任一个的nls序列)。

108、71.如实施例53-70中任一项所述的基因修饰系统，其在该人serpina1基因的第一链中产生第一切口。

109、72.如实施例71所述的基因修饰系统，其进一步包含第二链靶向性grna间隔子，该第二链靶向性grna间隔子将第二切口引导至该人serpina1基因的第二链。

110、73.如实施例72所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性grna包含含有来自表2的左grna间隔子序列或右grna间隔子序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该左grna间隔子序列或右grna间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。

111、74.如实施例72所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性grna包含含有对应于(i)的grna间隔子序列的表2中的左grna间隔子序列或右grna间隔子序列的核心核苷酸的序列，并且任选地包含从该左grna间隔子序列或右grna间隔子序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。

112、75.如实施例72所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性grna包含含有表4中第二切口grna序列的核心核苷酸的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且任选地包含从该第二切口grna序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。

113、76.如实施例72所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性grna包含含有对应于(i)的grna间隔子序列的表4中的第二切口grna序列的核心核苷酸的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，并且任选地包含从该第二切口grna序列的侧翼核苷酸的3’端开始的一个或多个连续核苷酸。

114、77.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性grna与该基因修饰系统的模板rna具有“pam-在内取向(pam-in orientation)”，例如，如表4中所例示的。

115、78.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统，该第二链靶向性grna靶向与该模板rna的靶突变重叠的序列。

116、79.如实施例78所述的基因修饰系统，其中该第二链靶向性grna包含：

117、(i)与serpina1突变互补的序列(例如，间隔子序列)；

118、(ii)与靶基因座处的野生型序列互补的序列(例如，间隔子序列)；

119、(iii)与接近该靶基因座的snp、例如受试者(例如，患者)的基因组dna中包含的snp互补的序列(例如，间隔子序列)；

120、(iv)与接近该靶基因座的一个或多个沉默取代互补或包含该一个或多个沉默取代的序列(例如，间隔子序列)。

121、80.如前述实施例中任一项所述的模板rna、基因修饰系统或grna，其中该grna间隔子包含该grna间隔子的约1、2、3或更多个侧翼核苷酸。

122、81.如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统，其中该异源对象序列包含该rt模板序列的约2、3、4、5、10、20、30、40或更多个侧翼核苷酸。

123、82.如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统，其中该异源对象序列包含约8-30、9-25、10-20、11-16、或12-15个(例如，约11-16个)核苷酸。

124、83.如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统，其中相对于该人serpina1基因的对应部分，该突变区包含1、2或3个核苷酸位置的序列差异。

125、84.如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统，其中相对于该人serpina1基因的对应部分，该突变区包含至少2个核苷酸位置的序列差异。

126、85.如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统，其中该编辑后同源区和/或编辑前同源区与该serpina1基因包含100％同一性。

127、86.如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统，其中该pbs序列另外包含约1、2、3、4、5、6、7或更多个侧翼核苷酸。

128、87.如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统，其中该pbs序列包含约5-20、8-16、8-14、8-13、9-13、9-12或10-12个(例如，约9-12个)核苷酸。

129、88.如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统，其中该pbs序列在该serpina1基因切口位点的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内结合。

130、89.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统，其中该基因修饰多肽的结构域通过肽接头连接。

131、90.如实施例89所述的基因修饰系统，其中该接头包含表10的接头序列(例如seqid no：5217、5106、5190和5218中任一个的接头序列)。

132、91.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统，其中该基因修饰多肽进一步包含一个或多个核定位序列(nls)。

133、92.如实施例91所述的基因修饰系统，其中该基因修饰多肽包含第一nls和第二nls。

134、93.如实施例91或92所述的基因修饰系统，其中该nls包含表11的nls序列(例如，seq id no：5245、5290、5323、5330、5349、5350、5351和4001中任一个的序列)。

135、94.一种模板rna，其包含表4中模板rna的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。

136、95.一种模板rna，其包含表4中模板rna的序列。

137、96.一种基因修饰系统，其包含：

138、(i)模板rna，其包含表4中模板rna的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列；以及

139、(ii)来自表4中与(i)同一行的第二切口grna序列，与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

140、97.一种基因修饰系统，其包含：

141、(i)模板rna，其包含表4中模板rna的序列；以及

142、(ii)来自表4中与(i)同一行的第二切口grna序列。

143、98.一种dna，其编码如实施例1-20、38-48、80-88、94或95中任一项所述的模板rna，或如实施例35-37中任一项所述的grna。

144、99.一种药物组合物，其包含如实施例52-93、96或97中任一项所述的系统，或编码该系统的一种或多种核酸，以及药学上可接受的赋形剂或载剂。

145、100.如实施例99所述的药物组合物，其中该药学上可接受的赋形剂或载剂选自由以下组成的组：质粒载体、病毒载体、囊泡和脂质纳米颗粒。

146、101.如实施例100所述的药物组合物，其中该病毒载体是腺相关病毒。

147、102.一种宿主细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞)，其包含如前述实施例中任一项所述的模板rna或基因修饰系统。

148、103.一种制备如实施例1-20、38-48、80-88、94或953中任一项所述的模板rna的方法，该方法包括通过以下来合成该模板rna：通过体外转录(例如固态合成)或通过在允许产生该模板rna的条件下将编码该模板rna的dna引入宿主细胞。

149、104.一种用于修饰细胞中人serpina1基因中的靶位点的方法，该方法包括使该细胞与如实施例52-93、96或97中任一项所述的基因修饰系统或编码该基因修饰系统的dna接触，从而修饰细胞中该人serpina1基因中的靶位点。

150、105.一种用于修饰细胞中人serpina1基因中的靶位点的方法，该方法包括使该细胞与以下接触：(i)如实施例52-93、96或97中任一项所述的模板rna，或编码其的dna；以及(ii)基因修饰多肽或编码基因修饰多肽的核酸，从而修饰细胞中该人serpina1基因中的靶位点。

151、106.一种用于治疗患有与人serpina1基因突变相关的疾病或病况的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例52-93、96或97中任一项所述的基因修饰系统或编码该基因修饰系统的dna，从而治疗该患有与人serpina1基因突变相关的疾病或病况的受试者。

152、107.一种用于治疗患有与人serpina1基因突变相关的疾病或病况的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例52-93、96或97中任一项所述的模板rna或编码其的dna；以及(ii)基因修饰多肽或编码基因修饰多肽的核酸，从而治疗该患有与人serpina1基因突变相关的疾病或病况的受试者。

153、108.如实施例106或107所述的方法，其中该疾病或病况是α-1抗胰蛋白酶缺乏症(aatd)。

154、109.如实施例106-108中任一项所述的方法，其中该受试者具有e342k突变(即，piz突变)。

155、110.一种用于治疗患有aatd的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例52-93、96或97中任一项所述的基因修饰系统或编码该基因修饰系统的dna，从而治疗该患有aatd的受试者。

156、111.一种用于治疗患有aatd的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用(i)如实施例52-93、96或97中任一项所述的模板rna或编码其的dna，以及(ii)基因修饰多肽或编码基因修饰多肽的核酸，从而治疗该患有aatd的受试者。

157、112.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中将该系统引入靶细胞会导致该serpina1基因的致病性突变纠正。

158、113.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该致病性突变是e342k突变，并且其中该纠正包括k342e的氨基酸取代。

159、114.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该突变的纠正发生在至少30％(例如，30％、40％、50％、60％、70％或更多)的靶核酸中。

160、115.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该突变的纠正发生在至少30％(例如，30％、40％、50％、60％、70％或更多)的靶细胞中。

161、116.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该基因修饰系统包含第二链靶向性grna，并且其中相对于用包含模板rna而无第二链靶向性grna的基因修饰系统处理的靶细胞群体，靶细胞群体中突变的纠正增加。

162、117.如前述实施例中任一项所述的基因修饰系统或方法，其中该模板rna包含一个或多个沉默取代(例如，如表7b中例示的)，并且其中相对于用包含不含有一个或多个沉默取代的模板rna的基因修饰系统处理的靶细胞群体，靶细胞群体中该突变的纠正增加。

163、118.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。

164、119.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该受试者是人。

165、120.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该接触离体发生，例如，其中该细胞或受试者的dna离体修饰。

166、121.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该接触在体内发生，例如，其中该细胞或受试者的dna在体内修饰。

167、122.如前述实施例中任一项所述的方法，其中使该细胞或该受试者与该系统接触包括在允许产生该基因修饰多肽的条件下使该细胞或该受试者体内的细胞与编码该基因修饰多肽的核酸(例如dna或rna)接触。