基于DNA的样品中海产食品物种的鉴定的制作方法

本发明涉及dna条形码的，特别是一种样品中海产食品物种的鉴定方法，包括以下步骤：从样品中分离dna，使用特定引物扩增分离的dna的片段，对扩增的dna片段进行测序，并通过与参考序列的序列比对鉴定海产食品物种。本文还提供了引物文库和试剂盒。

背景技术：

1、食品掺假是一个世界性的问题，涉及各种食品，例如农场动物、野生动物、海产食品和植物产品。食品掺假术语没有统一的定义，但一般来说，它是指为了无限制地获得经济利益的食品错误申报(robson,k等人，2021)。海产食品具有很高的欺诈风险，海产食品产品经常被错误标注。根据pardo,m等人(2016)的研究，全球高达27％的海产食品被错误标注。食品掺假包括但不限于，替代((有价值的)成分被较低价值的成分取代)，重新标注或错误标注的食品。当对同一物种使用不同的当地名称时，当对不同物种使用相同的名称时，或者由于翻译错误，可能导致不正确的标注。

2、然而，海产食品产品的正确标注对于可追溯性问题、濒危物种保护、非法捕捞的减少以及最终消费者的个人原因非常重要(rodríguez,e.m.和ortea,i.，2017)。

3、欧盟规定了海产食品的正确申报。因此，存在国际和国家法规以确保海产食品和海产食品产品的合法贸易。欧盟第1379/2013号指令规定了渔业和水产养殖产品的市场组织，包括海产食品的正确申报。为遵守法律规定，标签必须包括官方语言的当地商品名称和正确的科学拉丁名称(第1379/2013号法规(欧盟)；第1169/2011号法规(欧盟))。

4、尽管对物种申报有明确和严格的要求，但在欧洲仍多次发现例如双壳类产品的错误标注(g等人，2012；fernandes,t.等人，2020)。在德国和瑞士的研究中，半数以上宣称含有“扇贝(jakobsmuschel)”(或“扇贝(jacobsmuschel)”)的产品标注错误。虽然德语名称“扇贝(jakobsmuschel)”(或“扇贝(jacobsmuschel)”)可能仅用于扇贝属的扇贝物种，但在这些产品中发现了其它属的物种(特别是海扇蛤(placopecten)和虾夷扇贝属(mizuhopecten))(g.等人,2012；stephan,r.等人，2014)。

5、由于海产食品在人类营养中的重要性增加，遵守法规尤为重要。2019年，海产食品(甲壳动物和软体动物)的销售收入为1076亿美元，而30年前仅为81亿美元。2019年，自然捕捞贻贝、扇贝和牡蛎103万吨，水产养殖业养殖了多于1000万吨，赚取了数百万美元的利润。2019年，全球捕获了610万吨甲壳动物，养殖了1050万吨。同年，捕获了640万吨软体动物，养殖了1760万吨。

6、甲壳动物和软体动物分为许多属，包括世界范围内分布的大量物种。例如，一类软体动物是双壳类，其中贻贝科(贻贝)、扇贝科(扇贝)和牡蛎科(牡蛎)是人类食用的最重要的双壳类物种。这些双壳类物种中的每一种都分为多个属，包括大量的物种，这使得使用已知方法正确鉴定海产食品物种变得困难。

7、对于海产食品，特别是双壳类，例如外壳、颜色和大小的形态特征可用于正确的物种分类。然而，在去壳或机械加工后，通过形态学分类可能会受到阻碍，甚至不可能(m.等人，2009；fernández,a.等人，2000)。

8、最近，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)已被证明适用于扇贝的准确物种鉴定(stephan,r.等人，2014)。但是，maldi-tof ms仪器价格昂贵，且无法进行高通量分析。因此，这种方法不太适用于常规分析和多种海产食品物种的快速鉴定。

9、最近开发了用于鉴定食品中哺乳动物和家禽物种的dna元条形码方法(dobrovolny s.等人，2019)。

10、jp 2010004890公开了用于检测鲭鱼、鲑鱼、鲍鱼、鱿鱼、蟹和虾的引物和方法。

11、marin a.等人(2015)公开了使用扇贝科特异性的引物扩增16s rrna基因5'端的部分区域，作为扇贝的条形码工具。

12、marin a.等人(2017)公开了使用物种特异性引物靶向16s rrna基因的可变5'端的用于扇贝物种检测的十重pcr检测方法(decaplex pcr assay)。

13、wen j.等人(2017)讨论了通过dna条形码和使用coi和16srrna基因的系统发育分析的头足类产品的物种界定。

14、spielmann g.等人(2019)公开了三个dna标记区域对其鉴定与食物相关的十足目甲壳动物的适用性的比较。

15、sun s.等人(2021)描述了dna条形码在干贝产品(例如扇贝、鱿鱼、章鱼和墨鱼)的鉴定中的应用

16、klapper r.等人(2021)公开了通过多重实时pcr鉴定的商业扇贝物种的鉴定。

17、gense k.等人(2021)公开了一种用于海产食品产品中双壳类物种鉴定的dna元条形码方法。

18、但是，目前仍缺乏提供食物样品中存在的多种海产食品物种的全面信息的方法。因此，该领域亟需鉴定复杂和加工食品中的多种不同海产食品物种的改进方法，适用于常规分析中的食品鉴定。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供改进的手段和方法，用于食物样品中多种不同海产食品物种的鉴定。

2、通过本发明的主题实现了这一目的。

3、本发明提供了一种高度适用于复杂食物样品中不同产地和加工程度的海产食品物种的鉴定方法。本发明的发明人惊奇地发现了引物的文库，它可以被纳入快速可靠的元条形码方法中，用于食物样品中多种海产食品物种的鉴定。因此，发现文库的特定引物序列特别适合在扩增步骤中组合引物，因为它们适合在相似的条件下扩增，例如在相似甚至相同的温度下。pcr反应中使用的温度在很大程度上取决于反应中使用的引物序列的具体特征，即使引物序列略有改变，温度也可能变化。例如，由于pcr反应的退火温度取决于所用引物的熔化温度，因此具有不同熔化温度的引物很难在一个pcr反应中成功组合。本发明所述的本发明的另一个优点在于，本方法基于特定的引物序列和引物的长度具有高度特异性。本发明即使在高度加工的食物中，也能以低pcr循环数成功地鉴定海产食品物种。低pcr循环减少了非特异性pcr结果，从而获得高度可靠的结果，特别是通过防止假阳性结果。

4、根据本发明，提供了一种鉴定样品中海产食品物种的方法，包括以下步骤：

5、a)从样品中分离dna，

6、b)使用选自以下组中的一个或多个引物集(ps)扩增所述dna的片段：

7、i.用于鉴定甲壳科海产食品物种的ps 1，包括选自seq id no:1和2中任意一个的一个正向引物，和反向引物seq id no:15，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

8、ii.用于鉴定头足科海产食品物种的ps 2，包括选自seq id no:3至5中任意一个的一个正向引物，和反向引物seq id no:16，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

9、iii.用于鉴定腹足科海产食品物种的ps 3，包括正向引物seq id no:6，和选自seq id no:17至18中任意一个的一个反向引物，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

10、iv.用于鉴定帘蛤科海产食品物种的ps 4，包括选自seq id no:7至11中任意一个的一个正向引物，和选自seq id no:19至21中任意一个的一个反向引物，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

11、v.用于鉴定牡蛎科海产食品物种的ps 5，包括正向引物seq id no:12和反向引物seq id no:22，和/或引物序列的反向互补序列；

12、vi.用于鉴定扇贝科海产食品物种的ps 6，包括正向引物seq id no:13和反向引物seq id no:23，和/或引物序列的反向互补序列；和

13、vii.用于鉴定贻贝科海产食品物种的ps 7，包括正向引物seq id no:14，和选自seq idno:24至25中任意一个的一个反向引物，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

14、c)对步骤b)扩增的dna片段进行测序，和

15、d)通过将步骤a)至步骤c)获得的序列与海产食品物种的参考序列进行比较，鉴定海产食品物种。

16、具体地，步骤b)中扩增dna的片段通过聚合酶链反应(pcr)进行，优选地通过包括25-30个循环，更优选地25个循环的pcr进行，优选地在60-65℃的退火温度下，更优选地在62℃的退火温度下。

17、具体地，步骤b)中扩增dna的片段使用至少1、2、3、4、5、6或7个引物集进行。

18、具体地，步骤b)中扩增的dna片段为16s rdna片段，优选地，所述扩增的dna片段包括120bp-220bp的16s rdna。

19、具体地，海产食品物种的参考序列包括所述海产食品物种的16s rdna的dna序列。

20、更具体地，所述参考序列为seq id no:28至1153中的任意一个，或其任意组合。

21、具体地，鉴定的甲壳科物种选自以下组1：字纹弓蟹(varuna litterata)、粉碎型虾蛄(hemisquilla ensigera)、史氏指虾蛄(gonodactylus smithii)、托马西白虾(pullosquilla thomassini)、三叶虾蛄(chorisquilla trigibbosa)、尖刺栗蟹(telmessus acutidens)、金霸王蟹(lithodes aequispinus)、棘刺龙虾(panulirusechinatus)、圣保罗岩龙虾(jasus paulensis)、奥鲁姆洞穴虾(jasus caveorum)、皮毛副虾(parastacus pilimanus)、巴西原螯虾(parastacus brasiliensis)、桡桡蛄(parastacus defossus)、nicoleti鳌虾(parastacus nicoleti)、光滑独指虾蛄(gonodactylus graphurus)、南非静龙虾(jasus lalandii)、皮尤吉特湾王蟹(lopholithodes mandtii)、深水帝王蟹(lithodes spp.)、挪威巨蟹(lithodes maja)、澳洲岩龙虾(jasus edwardsii)、皇刺龙虾(panulirus regius)、多刺龙虾(panuliruspascuensis)、滑尾龙虾(panulirus laevicauda)、绿刺龙虾(panulirus gracilis)、斑点龙虾(panulirus guttatus)、条纹龙虾(panulirus femoristriga)、雪蟹(chionoecetesspp.)、南方伪帝王蟹(paralomis granulosa)、龙虾(panulirus spp.)、琵琶虾(scyllarusarctus)、棘刺龙虾(palinurus elephas)、密栉上相手蟹(episesarma mederi)、巨石螯虾(austropotamobius torrentium)、颗粒梭子蟹(cycloachelous granulatus)、直额绒螯蟹(eriocheir recta)、东方黄扁虾(cervimunida johni)、佛罗里达滨虾(achelousfloridanus)、萨氏梭子蟹(portunus sayi)、剑形梭子蟹(portunus anceps)、欧非真龙虾(palinurus mauritanicus)、佛得角刺龙虾(palinurus charlestoni)、多毛假虾蛄(pseudosquilla ciliata)、滨斑节铠甲虾(pleuroncodes monodon)、腹梭子蟹(portunusventralis)、刺腕鼓虾(achelous spinicarpus)、蓝泳蟹(callinectes toxotes)、蓝泳短浆蟹(callinectes danae)、华丽侧蟹(callinectes ornatus)、边缘蓝蟹(callinectesmarginatus)、近亲蓝蟹(callinectes affinis)、蓝氏蓝蟹(callinectes rathbunae)、博氏蓝蟹(callinectes bocourti)、小蓝蟹(callinectes similis)、勇士棕蟹(callinectesbellicosus)、弓形蓝蟹(callinectes arcuatus)、胄甲后海螯虾(metanephropsarmatus)、莫桑比克后海螯虾(metanephrops mozambicus)、日本后海螯虾(metanephropsjaponicus)、后海螯虾(metanephrops spp.)、宾氏后海螯虾(metanephrops binghami)、帕格纳副虾(parastacus pugnax)、库氏矛螯虾(paranephrops zealandicus)、埃氏蓝蟹(callinectes exasperatus)、刺龙虾(palinurus spp.)、绿色岩石龙虾(sagmariasusverreauxi)、红色后海螯虾(metanephrops rubellus)、南极深海螯虾(metanephropschallengeri)、海神后海螯虾(metanephrops neptunus)、澳大利亚海螯虾(metanephropsaustraliensis)、阿拉弗白后海螯虾(metanephrops arafurensis)、波氏后海螯虾(metanephrops boschmai)、中国台湾后海螯虾(metanephrops formosanus)、中华后海螯虾(metanephrops sinensis)、铁石蟹(lithodes ferox)、断脊小口虾蛄(oratosquillinainterrupta)、日本齿指虾蛄(odontodactylus japonicus)、长叉口虾蛄(miyakellanepa)、伍氏平虾蛄(erugosquilla woodmasoni)、饰尾绿虾蛄(clorida decorata)、窝纹虾蛄(dictyosquilla foveolata)、条尾近虾蛄(anchisquilla fasciata)、霍氏拟蝉虾(scyllarides herklotsii)、奥斯塔欧洲螯虾(astacus astacus)、矛形梭子蟹(portunushastatus)、奥氏螯虾(achelous ordwayi)、普通滨蟹(carcinus maenas)、对称梭子蟹(portunus inaequalis)、马达加斯加淡水螯虾(astacoides madagascariensis)、伊氏毛甲蟹(erimacrus isenbecki)、澳大利亚半指虾蛄(hemisquilla australiensis)、苍南虾蛄(austrosquilla tsangi)、伪虾蛄(fallosquillafallax)、盖氏棘虾蛄(echinosquillaguerinii)、科洛尼斯蜈蚣(coronis scolopendra)、特氏裂虾蛄(chorisquillatweediei)、红裂虾蛄(chorisquilla hystrix)、挖掘裂虾蛄(chorisquilla excavate)、植物牛虾蛄(busquilla plantei)、太平洋海虾蛄(alima pacifica)、东方海虾蛄(alimaorientalis)、小琴虾蛄(alachosquilla vicina)、棘突指虾蛄(gonodactylellusespinosus)、近缘小指虾蛄(gonodactylellus affinis)、尖刺口虾蛄(kempella mikado)、加州半指虾蛄(hemisquilla californiensis)、三刺定虾蛄(haptosquilla trispinosa)、雕尾定虾蛄(haptosquilla glyptocercus)、宽体指虾蛄(gonodactylus platysoma)、镰状独指虾蛄(gonodactylaceusfalcatus)、齐氏指虾蛄(gonodactylus childi)、白尾指虾蛄(gonodactylellus annularis)、雀尾螳螂虾(odontodactylus scyllarus)、宽吻齿虾蛄(odontodactylus latirostris)、哈瓦那齿指虾蛄(odontodactylus havanensis)、脊尾齿指虾蛄(odontodactylus cultrifer)、大趾虾蛄(neogonodactylus oerstedii)、布氏新趾虾蛄(neogonodactylus bredini)、巴伊亚洪丹西斯新趾虾蛄(neogonodactylusbahiahondensis)、沟拟琴虾蛄(lysiosquillina sulcata)、褶皱虾蛄(squilla rugosa)、希伦虾蛄(raoulserenea spp.)、尖额希伦虾蛄(raoulserenea oxyrhyncha)、云斑假虾蛄(pseudosquillopsis marmorata)、希伦虾蛄(raoulserenea komaii)、福利亚原虾蛄(protosquillafolini)、斜角扇虾(ibacus alticrenatus)、结节拟蝉虾(scyllaridesnodifer)、韩氏拟扇虾(scyllarides haanii)、巴西拟蝉虾(scyllarides brasiliensis)、塔库垒粉蚧(taku spinosocarinatus)、智利龙虾(jasus frontalis)、半岛原河龙虾(procambarus paeninsulanus)、细指游龙虾(puerulus sewelli)、黄斑龙虾(panuliruspolyphagus)、长足龙虾(panulirus longipes)、断沟龙虾(panulirus interruptus)、夏威夷多刺龙虾(panulirus marginatus)、巴尔曼螯虾(ibacus peronii)、巴尔曼螯虾(ibacuschacei)、红颊侏儒螯虾(faxonella clypeata)、昆次假河龙虾(fallicambaruskountzeae)、墨西哥竞技蛛(arenaeus mexicanus)、鞑靼螯虾(cambarus tartarus)、深海雪蟹(chionoecetes tanneri)、塔尔塔罗斯螯虾(thenus unimaculatus)、印度扁虾(thenus indicus)、哈氏定虾蛄(haptosquilla hamifera)、塔形石蟹(lithodesturritus)、罗氏布查德龙虾(bouchardina robisoni)、马氏洞河龙虾(troglocambarusmaclanei)、亚洛布沙霍布斯虾(hobbseus yalobushensis)、隆背霍布斯虾(hobbseusprominens)、蟳(charybdis spp.)、纤瘦霍氏虾(hobbseus petilus)、塞氏小法氏虾(faxonella creaseri)、少刺长桨蟹(thranita danae.)、彼氏拥剑蟹(monomia petrea)、温氏新趾虾蛄(neogonodactylus wennerae)、假矛形梭子蟹(xiphonectespseudohastatoides)、绿色小趾虾蛄(gonodactylellus viridis)、三线独指虾蛄(gonodactylaceus ternatensis)、光滑贝洛斯奎拉虾(belosquilla laevis)、奥卡卢萨原河龙虾(procambarus okaloosae)、莫氏原河龙虾(procambarus morrisi)、米氏原河龙虾(procambarus milleri)、残弱原河龙虾(procambarus mancus)、伦氏原河龙虾(procambarus lunzi)、具脊霍氏虾(hobbseus cristatus)、极锐原河龙虾(procambarusacutissimus)、佩氏法氏虾(faxonius pagei)、皮莱曼宁虾蛄(manningia pilaensis)、细指咸水螯虾(pontastacus leptodactylus)、地理带原河龙虾(procambarus zonangulus)、杨氏原河龙虾(procambarus youngi)、塞米诺尔原河龙虾(procambarus seminolae)、坚髋原河龙虾(procambarus pycnogonopodus)、冥界原河龙虾(procambarus orcinus)、淡色原河龙虾(procambarus pallidus)、巨型软雕海虾蛄(alima max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robrachium rude)、拉马雷沼虾(macrobrachium lamarrei)、桑科利沼虾(macrobrachium sankolli)、大叶山沼虾(macrobrachium gangeticum)、巴勒斯坦鹰爪虾(trachysalambria palaestinensis)、太平洋磷虾(euphausia pacifica)、光亮磷虾(euphausia lucens)、华氏磷虾(euphausia vallentini)、三棘磷虾(euphausiatriacantha)、长额磷虾(euphausia longirostris)、南极磷虾(euphausia similis)、反曲磷虾(euphausia recurve)、克氏磷虾(euphausia krohni)、冷磷虾(euphausia frigida)、长臂磷虾(euphausia gibboides)、奇异磷虾(euphausia eximia)、美洲磷虾(euphausiaamericana)、柔弱磷虾(euphausia tenera)、假驼磷虾(euphausia pseudogibba)、半酿磷虾(euphausia hemigibba)、短小磷虾(euphausia brevis)、弱对虾(hymenopenaeusdebilis)和细足白虾(nematopalaemon tenuipes)(组1)。

22、更具体地，鉴定的甲壳科物种选自组1，列于组1a：澳洲岩龙虾(jasusedwardsii)、日本后海螯虾(metanephrops japonicus)、奥斯塔欧洲螯虾(astacusastacus)、中华绒螯蟹(eriocheir sinensis)、普通黄道蟹(cancer pagurus)、灰眼雪蟹(chionoecetes opilio)、天空蓝魔虾(cherax destructor)、美洲螯龙虾(homarusamericanus)、堪察加拟石蟹(paralithodes camtschaticus)、克氏原螯虾(procambarusclarkii)、欧洲龙虾(homarus gammarus)、挪威海螯虾(nephrops norvegicus)、眼斑龙虾(panulirus argus)、白对虾(penaeus setiferus)、长带似须虾(aristaeopsisedwardsiana)、褐虾(crangon)、北方长额虾(pandalus borealis)、独角新对虾(metapenaeus monoceros)、南方桃红对虾(penaeus notialis)、粉红沟虾(penaeusduorarum)、南美白对虾(penaeus vannamei)、罗氏沼虾(macrobrachium rosenbergii)、斑节对虾(penaeus monodon)、加州对虾(penaeus californiensis)、阿根廷红虾(pleoticusmuelleri)、印度对虾(penaeus indicus)、和拥剑梭子蟹(monomia gladiator)。

23、更具体地，鉴定的甲壳科物种选自组1，列于组1b：普通黄道蟹(cancer pagurus)、灰眼雪蟹(chionoecetes opilio)、美洲螯龙虾(homarus americanus)、堪察加拟石蟹(paralithodes camtschaticus)、克氏原螯虾(procambarus clarkii)、欧洲龙虾(homarusgammarus)、挪威海螯虾(nephrops norvegicus)、眼斑龙虾(panulirus argus)、褐虾(crangon)、北方长额虾(pandalus borealis)、独角新对虾(metapenaeus monoceros)、南美白对虾(penaeus vannamei)、罗氏沼虾(macrobrachium rosenbergii)、斑节对虾(penaeus monodon)和阿根廷红虾(pleoticus muelleri)。

24、具体地，鉴定的头足科物种选自以下组2：福氏枪乌贼(loligo forbesii)、双柔鱼(nototodarus sloanii)、乌贼(sepia spp.)、蛛形乌贼(sepia lorigera)、豹纹甲乌贼(sepia pardex)、太平洋僧头乌贼(rossia pacifica)、贝乌贼(berryteuthis magister)、大爱尔斗蛸(eledone massyae)、罗氏乌贼(sepia robsoni)、好望角枪乌贼(loligoreynaudii)、皮氏(美洲)枪乌贼(doryteuthis(amerigo)pealeii)、巴塔哥尼亚(美洲)枪乌贼(doryteuthis(amerigo)gahi)、耳乌贼(sepiola rondeletii)、乌舌状亚细亚(adinaefiola ligulata)、史密斯乌贼(sepia smithi)、椭乌贼(sepia elliptica)、绵腕爱尔斗蛸(eledone palari)、爱尔斗蛸(eledone moschata)、僧头乌贼(rossiapalpebrosa)、马氏黵乌贼(gonatus madokai)、日本短腕黵乌贼(gonatuskamtschaticus)、尖盘爱尔斗蛸(eledone cirrhosa)、雅乌贼(sepia elegans)、双乳突僧头乌贼(rossia bipillata)、大西洋耳乌贼(sepiola atlantica)、巴拿马圆鳍枪乌贼(lolliguncula(lolliguncula)panamensis)、玛雅蛸(octopus maya)、短鳍鱿鱼(illexillecebrosus)、澳洲双柔鱼(nototodarus gouldi)、拟黵乌贼(gonatopsisoctopedatus)、科式滑柔鱼(illex coindetii)、无钩贝乌贼(berryteuthis anonychus)、黵乌贼(gonatusfabricii)、双喙耳乌贼(lusepiola birostrata)、郁蛸(octopustetricus)、诗博加枪乌贼(uroteuthis(photololigo)sibogae)、普氏枪乌贼(doryteuthis(doryteuthis)pleii)、圣保罗美洲枪乌贼(doryteuthis sanpaulensis)、苏里南(美洲)枪乌贼(doryteuthis(amerigo)surinamensis)、哈勃氏蛸(octopus hubbsorum)、长臂章鱼(macrotritopus defilippi)、岛章鱼(octopus insularis)、苏门答腊小枪乌贼(loliolus(nipponololigo)sumatrensis)、曲真乌贼(sepia recurvirostra)、马氏乌贼(sepiamadokai)、神户乌贼(sepia kobiensis)、砂蛸(amphioctopus aegina)、普通乌贼(sepiaofficinalis)、莱氏拟乌贼(sepioteuthis lessoniana)、太平洋褶柔鱼(todarodespacificus)、真蛸(octopus vulgaris)、长枪乌贼(heterololigo bleekeri)、中华蛸(octopus sinensis)、美洲章鱼(octopus americanus)、窄新乌贼(narrowteuthisnesisi)、柔鱼(ommastrephes bartramii)、日本无针乌贼(sepiellajaponica)、剑尖尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)edulis)、乳光美洲枪乌贼(doryteuthis(amerigo)opalescens)、大王乌贼(architeuthis dux)、茎柔鱼(dosidicus gigas)、金乌贼(sepiaesculenta)、两鳍蛸(amphioctopus fangsiao)、枪乌贼(loligo vulgaris)、耳乌贼(sepiola spp.)、负蛸(octopus mimus)、蛸(octopus spp.)、加利福尼亚双斑蛸(octopusbimaculoides)、中国尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)chinensis)、杜氏尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)duvaucelii)、阿根廷滑柔鱼(illex argentinus)、目乌贼(sepia aculeata)、无针乌贼(sepiella inermis)、拟目乌贼(sepia lycidas)、白斑乌贼(sepia latimanus)、伞膜乌贼(sepia apama)、虎斑乌贼(sepia pharaonis)、火枪乌贼(loliolus(nipponololigo)beka)、锥异尾枪乌贼(alloteuthis subulata)、夏威夷双柔鱼(nototodarus hawaiiensis)、粉红乌贼(sepia orbignyana)、巴布亚乌贼(sepiapapuensis)、巨粒僧头乌贼(rossia macrosoma)、圆鳍枪乌贼(lolliguncula(lolliguncula)brevis)、镖形圆鳍枪乌贼(lolliguncula(loliolopsis)diomedeae)、非洲枪乌贼(afrololigo mercatoris)、双斑蛸(octopus bimaculatus)、蓝蛸(octopuscyanea)、奥纳柔蛸(callistoctopus ornatus)、红色肠腕蛸(enteroctopusmegalocyathus)、萨勒布罗苏斯佐崎氏蛸(sasakiopus salebrosus)、南方脊蛸(octopusberrima)、马金两鳍蛸(amphioctopus marginatus)、毛利蛸(octopus maorum)、菲氏蛸(octopus fitchi)、纳克两鳍蛸(amphioctopus neglectus)、尤氏小枪乌贼(loliolus(nipponololigo)uyii)、日本小枪乌贼(loliolus(nipponololigo)japonica)、深海乌贼(bathyteuthis abyssicola)、巴塔哥尼亚半僧头乌贼(semirossia patagonica)、中国台湾小孔蛸(cistopus taiwanicus)、鸢乌贼(sthenoteuthis oualaniensis)、荧光乌贼(watasenia scintillans)、奥氏拟黵乌贼(gonatopsis okutanii)、夜光尾枪乌贼(uroteuthis(aestuariolus)noctiluca)、澳大利亚拟乌贼(sepioteuthis australis)、拟乌贼(sepioteuthis sepioidea)、康氏两鳍蛸(amphioctopus kagoshimensis)、膜蛸(amphioctopus membranaceus)、线两鳍蛸(amphioctopus exannulatus)、小两鳍蛸(amphioctopus rex)和彼得森乌贼(sepia peterseni)(组2)。

25、更具体地，鉴定的头足科物种选自组2，列于组2a：巴塔哥尼亚(美洲)枪乌贼(doryteuthis(amerigo)gahi)、爱尔斗蛸(eledone moschata)、玛雅蛸(octopus maya)、普氏枪乌贼(doryteuthis(doryteuthis)pleii)、砂蛸(amphioctopus aegina)、普通乌贼(sepia officinalis)、真蛸(octopus vulgaris)、日本无针乌贼(sepiella japonica)、剑尖尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)edulis)、乳光(美洲)枪乌贼(doryteuthis(amerigo)opalescens)、茎柔鱼(dosidicus gigas)、枪乌贼(loligo vulgaris)、中国尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)chinensis)、杜氏尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)duvaucelii)、无针乌贼(sepiella inermis)、虎斑乌贼(sepia pharaonis)和膜蛸(amphioctopus membranaceus)。

26、更具体地，鉴定的头足科物种选自组2，列于组2b：巴塔哥尼亚(美洲)枪乌贼(doryteuthis(amerigo)gahi)、普氏枪乌贼(doryteuthis(doryteuthis)pleii)、普通乌贼(sepia officinalis)、真蛸(octopus vulgaris)、日本无针乌贼(sepiella japonica)、剑尖尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)edulis)、茎柔鱼(dosidicus gigas)、枪乌贼(loligo vulgaris)、中国尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)chinensis)和杜氏尾枪乌贼(uroteuthis(photololigo)duvaucelii)。

27、具体地，鉴定的腹足科物种选自以下组3：罗马蜗牛(helix pomatia)、褐云玛瑙螺(achatina fulica)、散大蜗牛(helix aspersa)、大螺旋蜗牛(helix aspersa maxima)、大叶蜗牛(helix thessalica)、光亮大蜗牛(helix lucorum)、尼西亚蜗牛(helixnicaeensis)、网纹大蜗牛(achatina reticulata)、大孔蜗牛(helix aperta)、白色蜗牛(helix albescens)、角状蜗牛(tyrrhenaria ceratina)、弗拉迪卡蜗牛(helix vladika)、蜗牛(helix spp.)、变色肋齿蜗牛(pleurodonte discolor)、侧肋齿蜗牛(pleurodontelychnuchus)、马祖利蜗牛(erctella mazzullii)、头状蜗牛(erctella cephalaeditana)、中国台湾肋齿蜗牛(pleurodonte formosa)、赫氏蜗牛(helix christophi)、诺氏蜗牛(helix nordmanni)、核仁肋齿蜗牛(pleurodonte nucleola)、帕里斯肋齿蜗牛(pleurodonte parilis)、耳状角口蜗牛(gonostomopsis auridens)、卡拉科勒斯光芒蜗牛(caracolus caracollus)、瑟琳娜乳状蜗牛(lacteoluna selenina)、南阿尔卑斯白蜗牛(cernuella cisalpine)、尖头旋蜗牛(cochlicella acuta)、双球马德拉蜗牛(disculellamaderensis)、双球内莫拉罗蜗牛(dialeuca nemoraloides)、信念蒙纳螺(monadeniafidelis)、森林葱蜗牛(cepaea nemoralis)、白纹括约肌蜗牛(sphincterochila candidissima)、英格索利微蜗牛(microphysula ingersolli)、上旋齿蜗牛(helicodonta obvoluta)和普通白蜗牛(cernuella virgata)(组3)。

28、更具体地，鉴定的腹足科物种选自组3，列于组3a：罗马蜗牛(helix pomatia)、褐云玛瑙螺(achatina fulica)、散大蜗牛(helix aspersa)、大螺旋蜗牛(helix aspersamaxima)、光亮大蜗牛(helix lucorum)和网纹大蜗牛(achatina reticulata)。

29、更具体地，鉴定的腹足科物种选自组3，列于组3b：罗马蜗牛(helix pomatia)和网纹大蜗牛(achatina reticulata)。

30、具体地，鉴定的帘蛤科物种选自以下组4：魔鬼砗磲(tridacna mbalavuana)、高角蛤(siliqua alta)、择昂大角蛤(megangulus zyonoensis)脉纹大角蛤(megangulusvenulosus)、豆斧蛤(donaxfaba)、楔状斧蛤(donax cuneatus)、瘦斧蛤(donaxkiusiuensis)、四角蛤蜊(mactra quadrangularis)、恩西斯斧蛤(ensis ensis)、鸡帘蛤(chamelea gallina)、亚截形大西洋浪蛤(spisula subtruncata)、菱形蛤(polititapesrhomboides)、奇奥内仙女蛤(callista chione)、皱纹盘鲍蛤(venerupis corrugata)、金黄色蛤(polititapes aureus)、克雷布里舒卡帘蛤(venus crebrisulca)、南圆蛤(mercenaria campechiensis)、对角蛤(antigona lamellaris)、巴塔哥尼亚阿根廷蛤(ameghinomya antiqua)、巴塔哥尼亚蛤(ameghinomya spp.)、棕带仙女蛤(callistaerycina)、杂色蛤(venerupis aspera)、菲律宾巴非蛤蛤(paphia philippiana)、重甲帘蛤(venus casina)、剃刀蛤(ensis spp.)、白色槽壳蛤(mactra stultorum)、马查剃刀蛤(ensis macha)、小荚蛏(siliqua minima)、莱氏剃刀蛤(ensis leei)、清晰帘蛤(polititapes durus)、灰绿角蛤(cerastoderma glaucum)、砗磲(tridacna spp.)、长刺尾斧蛤(donax longissimus)、叶鞘竹蛏(solen vaginoides)、金色斧蛤(venus verrucosa)、短吻仙女蛤(ezocallista brevisiphonata)、印度蛤(procardiumindicum)、大女神鸟尾蛤(cardium maxicostatum)、女神鸟尾蛤(cardium costatum)、斧蛤(acanthocardiapaucicostata)、欧洲棘鸟尾蛤(acanthocardia echinata)、欧洲刺鸟尾蛤(acanthocardiaaculeata)、竹蛏(solen spp.)、菲律宾帘蛤(ruditapes philippinarum)、心鸟蛤(corculum cardissa)、马珂蛤(spisula solida)、平浅凹蛤(scrobicularia plana)、蛤蜊(mactra spp.)、纹状鸡帘蛤(chamelea striatula)、大刀蛏(ensis siliqua)、格陵兰锯齿蛤(serripes groenlandicus)、窄肋砗磲(tridacna elongatissima)、罗氏砗磲(tridacnarosewateri)、斧文蛤(meretrix lamarckii)、丽文蛤(meretrix lusoria)、真曲巴非蛤(paphia euglypta)、文蛤(meretrix spp.)、结瘤鸟尾蛤(acanthocardia tuberculata)、长砗磲(tridacna maxima)、弓獭蛤(lutraria rhynchaena)、琴文蛤(meretrix lyrata)、北极蛤(arctica islandica)、长竹蛏(solen strictus)、波纹巴非蛤(paratapesundulatus)、织锦巴非蛤(paratapes textilis)、和蔼巴非蛤(paphia amabilis)、大竹蛏(solen grandis))、大獭蛤(lutraria maxima)、条纹蛤(donax vittatus)、杂色蛤(donaxvariegatus)、长尾蛤(donax trunculus)、半纹蛤(donax semistriatus)、海蛤(ruditapesdecussatus)、欧洲鸟蛤(cerastoderma edule)、鳞砗磲(tridacna squamosa)、中国蛤蜊(mactra chinensis)和硬壳蛤(mercenaria mercenaria)(组4)。

31、更具体地，鉴定的帘蛤科物种选自组4，列于组4a：恩西斯斧蛤(ensis ensis)、鸡帘蛤(chamelea gallina)、奇奥内仙女蛤(callista chione)、金色斧蛤(venusverrucosa)、菲律宾帘蛤(ruditapes philippinarum)、大刀蛏(ensis siliqua)、琴文蛤(meretrix lyrata)、长尾蛤(donax trunculus和欧洲鸟蛤(cerastoderma edule)。

32、更具体地，鉴定的帘蛤科物种选自组4，列于组4b：恩西斯斧蛤(ensis ensis)、奇奥内仙女蛤(callista chione)、菲律宾帘蛤(ruditapes philippinarum)、琴文蛤(meretrix lyrata)和欧洲鸟蛤(cerastoderma edule)。

33、具体地，鉴定的牡蛎科物种选自以下组5：毕氏麦哲伦牡蛎(magallanabilineata)、太平洋牡蛎(magallana gigas)、维吉尼亚厚牡蛎(crassostrea virginica)、牡蛎(magallana spp.)、葡萄牙牡蛎(magallana angulata)、熊本牡蛎(magallanasikamea)、近江牡蛎(magallana ariakensis)、密鳞牡蛎(ostrea denselamellosa)、岩牡蛎(magallana nippona)、欧洲平牡蛎(ostrea edulis)、巨蛎属(crassostrea spp.)、郁金香牡蛎(crassostrea tulipa)、安加西牡蛎(ostrea angasi)、伯氏麦哲伦牡蛎(magallanabelcheri)、红牡蛎(crassostrea rhizophorae)、猫爪牡蛎(talonostrea talonata)、太平洋牡蛎(crassostrea corteziensis)、牡蛎(ostrea spp.)、智利牡蛎(ostreachilensis)、尖吻牡蛎(ostrea algoensis)、大齿牡蛎(ostrea megodon)、僧帽牡蛎(saccostrea cuccullata)、掌牡蛎(saccostrea palmula)、团聚牡蛎(saccostreamalabonensis)、钵牡蛎(saccostrea scyphophilla)、毛牡蛎(saccostrea kegaki)和小蛎属(saccostrea spp.)(组5)。

34、更具体地，鉴定的牡蛎科物种选自组5，列于组5a：太平洋牡蛎(magallanagigas)、维吉尼亚厚牡蛎(crassostrea virginica)和欧洲平牡蛎(ostrea edulis)。

35、具体地，鉴定的扇贝科物种选自以下组6：尤沃拉扇贝(euvola spp.)、华贵类栉孔扇贝(mimachlamys crassicostata)、荣套扇贝(gloripallium pallium)、柔扇贝(flexopecten glaber)、女王扇贝(aequipecten opercularis)、结节扇贝(nodipectennodosus)、青色栉孔扇贝(scaeochlamys livida)、海扇(pecten spp.)、多纹踵扇贝(talochlamys multistriata)、风信标扇贝(patinopecten caurinus)、贝林吉亚纳海扇蛤(chlamys behringiana)、七辐板扇贝(placopecten septemradiatus)、巨海扇蛤(pectenmaximus)、迷人海扇蛤(zygochlamys delicatula)、鱼叉海扇蛤(chlamys hastata)、日月蛤(ylistrumjaponicum)、吉穆拉塔踵扇贝(talochlamys gemmulata)、巴塔哥尼亚扇贝(zygochlamys patagonica)、紫扇贝(argopecten purpuratus)、海湾扇贝(argopectenirradians)、栉孔扇贝(azumapecten farreri)、虾夷扇贝(mizuhopecten yessoensi)、麦哲伦海扇蛤(placopecten magellanicus)、冰岛海扇蛤(chlamys islandica)、太平洋扇贝(argopecten ventricosus)、变异华贵类栉孔扇贝(mimachlamys varia)、长肋日月贝(amusium pleuronectes)、艳红海扇蛤(mimachlamys sanguinea)、常山踵扇贝(talochlamys dichroa)、荣类栉孔扇贝(mimachlamys gloriosa)、克拉克海扇蛤(mimachlamys cloacata)、阿斯彭马华贵类栉孔扇贝(mimachlamys asperrima)、美丽环扇贝(annachlamys striatula)、齿舌纹肋扇贝(decatopecten radula)、维西卢姆薄齿扇贝(bractechlamys vexillum)、雕齿女王扇贝(aequipecten glyptus)、带珊瑚扇贝(scaeochlamys lemniscata)、粉红扇贝(chlamys rubida)、苏卡达卡内坎皮亚扇贝(karnekampia sulcata)、岩扇贝(crassadoma gigantea)和球形耶利斯特鲁姆扇贝(ylistrum balloti)(组6)。

36、更具体地，鉴定的扇贝科物种选自组6，列于组6a：女王扇贝(aequipectenopercularis)、巨海扇蛤(pecten maximus)、雅各海扇蛤(pectenjacobaeus)、巴塔哥尼亚扇贝(zygochlamys patagonica)、紫扇贝(argopecten purpuratus)、虾夷扇贝(mizuhopecten yessoensi)和麦哲伦海扇蛤(placopecten magellanicus)。

37、具体地，鉴定的贻贝科物种选自以下组7：贻贝(mytilus spp.)、棕色贻贝(pernaperna)、厚壳贻贝(mytilus unguiculatus)、翡翠股贻贝(perna viridis)、加州贻贝(mytilus californianus)、油黑壳菜蛤(mytilus trossulus)、紫贻贝(mytilusgalloprovincialis)、紫壳菜蛤(mytilus edulis)和绿唇贻贝(perna canaliculus)(组7)。

38、更具体地，鉴定的贻贝科物种选自组7，列于组7a：棕色贻贝(perna perna)、加州贻贝(mytilus californianus)、油黑壳菜蛤(mytilus trossulus)、紫贻贝(mytilusgalloprovincialis)、紫壳菜蛤(mytilus edulis)和绿唇贻贝(perna canaliculus)。

39、更具体地，鉴定的贻贝科物种选自组7，列于组7b：紫贻贝(mytilusgalloprovincialis)、紫壳菜蛤(mytilus edulis)和绿唇贻贝(perna canaliculus)。

40、本文还提供了一种用于鉴定样品中海产食品物种的试剂盒，包括选自以下组的一个或多个引物集：

41、i.用于鉴定甲壳科海产食品物种的ps 1，包括选自seq id no:1和2中任意一个的一个正向引物，和反向引物seq id no:15，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

42、ii.用于鉴定头足科海产食品物种的ps 2，包括选自seq id no:3至5中任意一个的一个正向引物，和反向引物seq id no:16，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

43、iii.用于鉴定腹足科海产食品物种的ps 3，包括正向引物seq id no:6，和选自seq id no:17至18中任意一个的一个反向引物，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

44、iv.用于鉴定帘蛤科海产食品物种的ps 4，包括选自seq id no:7至11中任意一个的一个正向引物，和选自seq id no:19至21中任意一个的一个反向引物，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

45、v.用于鉴定牡蛎科海产食品物种的ps 5，包括正向引物seq id no:12和反向引物seq id no:22，和/或引物序列的反向互补序列；

46、vi.用于鉴定扇贝科海产食品物种的ps 6，包括正向引物seq id no:13和反向引物seq id no:23，和/或引物序列的反向互补序列；和

47、vii.用于鉴定贻贝科海产食品物种的ps 7，包括正向引物seq id no:14，和选自seq id no:24至25中任意一个的一个反向引物，和/或引物序列的反向互补序列的一个或多个引物对；

48、任选地进一步包括pcr组分、缓冲液、试剂和/或说明书。

49、本发明还提供了引物序列文库，包括seq id no:1至25中的任意一个，或seq idno:1至25的任意组合。