杨桃根提取物纳米制剂及其在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用

【】本发明涉及糖尿病肾病药物，具体涉及杨桃根提取物纳米制剂及其在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。

背景技术

0、背景技术：

1、糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，dkd)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病(end stage renal disease，esrd)的主要病因之一。肾小管及其间质占肾实质的90％以上，肾小管上皮细胞的凋亡过度是dkd的重要发病机制之一。

2、前期研究中，发明人从杨桃根中分离并鉴定出的2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮(2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione，dmdd)是一种黄酮类单体化合物，已经发现dmdd有降血糖、抗炎和抗肿瘤等药理作用。发明人采用高糖高脂联合链脲佐菌素(streptozotocin，stz)诱导糖尿病小鼠模型，探讨dmdd的抗糖尿病及肾脏保护作用。结果发现：dmdd不仅可以降低糖尿病小鼠空腹血糖、糖化血红蛋白；同时还可有效改善小鼠肾脏病理损伤，降低血肌酐、血尿素氮及改善蛋白尿症状。此外还发现dmdd可以降低糖尿病小鼠肾皮质中氧化/抗氧化酶水平，并抑制肾脏糖基化终末产物的形成及其相关蛋白的表达。

3、纳米技术是近几十年来医药领域新兴的科研方向，纳米化的物质由于其瞩目的特性，使其在医学、材料学、生命科学等方面得到广泛的应用。与传统中药相比，纳米中药具有以下优势：(1)提高中药的生物利用度；(2)被动靶向性；(3)缓释功能；(4)掩盖不良味道。根据纳米粒的上述特点，制备成纳米粒可以解决dmdd溶解度的问题，且可大大提高生物利用度。

4、纳米材料是指晶粒尺寸为纳米级的超细材料，它的尺寸比原子大，但小于通常的微粒，纳米材料的用途很广，医药领域使用纳米技术能使药品越来越精细，智能纳米药物进入人体后可主动选择并攻击癌细胞或修补损伤组织。科学界认为纳米技术与信息技术和生物技术是21世纪最有影响力的三大技术，21世纪是纳米的时代，纳米技术已在医药、生物、环境保护和化工等方面得到了广泛而高效的应用，展示出它独特的魅力。随着医疗技术的发展和人民生活水平的提高，对药品的需求也趋于精细化、个性化，精准医疗成为生物医药领域发展的新方向。纳米技术应用于中药制剂是近二十年来新兴的产业技术，作为后起新秀，它的优越性在于可以改善中药的溶解度、丰富给药方法、具有靶向性、缓释等作用从而提高中药的生物利用度。以纳米磁性材料作为药物载体的靶定向药物，对于肿瘤和栓塞以及高危部位损伤，由于纳米粒子结构精微可以在血管中灵活的移动，纳米药物的靶向以及无创修复具有重要临床应用价值，因此用于纳米药物对现代医学治疗具有极大好处。

5、纳米药物可分为纳米载体药物和纳米粒药物，常见的纳米载体有脂质体、胶束、纳米微囊和微球等；而纳米粒药物通常指的是将药物直接纳米化，制成纳米颗粒使用，如纳米结晶。常见的纳米药物有脂质体纳米粒、纳米乳、纳米球、聚合物胶束纳米混悬剂(纳米晶)、纳米囊、纳米球等。

6、白蛋白纳米粒是近几年新开发的载药系统，有生物可降解、无毒、无免疫原性等特点，主要用于抗肿瘤药物搭载。实体瘤的生长需要大量的氨基酸和能量，而白蛋白是实体瘤氨基酸和能量的主要来源，由于肿瘤细胞表面存在白蛋白结合受体gp60，白蛋白纳米粒与gp60受体结合，gp60进一步与一种细胞内蛋白质(caveolin-1)结合，接着细胞膜内陷产生转胞吞囊泡，使白蛋白纳米粒跨过内皮细胞，进一步与白蛋白结合蛋白(secreted protein,acidic and rich in cysteine，sparc)结合，可提高肿瘤内的累积量。辛娟等就用牛血清白蛋白制备了大黄酚白蛋白纳米粒，所得白蛋白纳米粒呈球形，包封率高达(93.61±1.02)％，载药量为(12.19±1.03)％，生物利用度增加至4.02倍。

7、纳米药物中，以纳米粒药物研究最广泛最成熟。脂质体纳米粒(liposomenanoparticles)主要采用熔融分散法制备，他的特点是毒性很低，包封率高，生物活性好，可用于经皮、注射、或口服给药，具有广泛的应用范围。还有很多研究者制备了磁性纳米粒药物，通过磁引导达到靶向作用，这项技术的发展对创伤、肿瘤以及血管栓塞等的靶向治疗具有十分重要的意义。纳米粒液态时稳定性往往不如固态，可以通过冷冻干燥或者喷雾干燥法来提高其稳定性。

8、纳米乳(nano emulsion)是粒径在10-100nm范围内的乳滴分散在另一种液相中形成的胶体分散体系，呈透明或半透明状，乳滴多为球形，大小比较均匀。纳米乳的制备方法有高压匀化法、超声分散法、微流态化法、自纳米乳化法、反相乳化法、相转变温度法、相转变组成法、乳状液转变点法等。纳米乳的主要优点有:能增大难溶性药物的溶解度，提高易水解药物的稳定性，也可作为缓释或靶向给药系统的载体；纳米乳稳定性高，黏度低，粒径和浊度几乎不随时间变化或变化较慢，不受血清蛋白的影响，在循环系统中的寿命很长，o/w型纳米乳在注射24h后油相25％以上仍然在血中。纳米乳的缺点是毒性偏大，而毒性主要来源于乳化剂或助乳化剂。在纳米乳的配方中，通常含有5-20％的油相，有时甚至高达70％。用于纳米乳剂的油相通常与药物的溶解度有关，还有研究报道，油相的选择可能影响纳米乳液液滴的尺寸大小。油相可以选择蓖麻油、棕榈油、亚油酸、肉豆蔻酸异丙酯、三甘油三酯、二甘油三酯或单酰基甘油三酯、植物油、矿物油、游离脂肪酸等。油相选择的依据依据是药物的溶解度，纳米乳的制备一般会选择高载药量的油相。表面活性剂的主要作用为降低油水界面张力，形成牢固的乳化膜，促进药物吸收，提高难溶性药物溶解度。纳米乳的给药方法有：注射给药、口服给药、黏膜给药、透皮给药等，给药方法丰富可选。

9、纳米球(nanospheres)和纳米囊(nanocapsules)的粒径通常在10-100nm范围内，纳米球为基质骨架型，药物主要被包裹或吸附在基质中，目前对纳米球的研究比较少，有研究者制备过米托蒽醌白蛋白纳米球和米托蒽醌固体脂质体纳米球，但中药方面研究甚少。纳米囊属于药库膜壳型，由高分子材料形成的外壳和液状内核构成，药物通常集中在内层或吸附在壳层表面。纳米囊是利用天然的或合成的高分子材料为囊材作为囊膜将固体药物或液体药物作囊心物包裹而成药库型微小胶囊。纳米囊在医药领域主要用于包覆药物，使制成纳米微囊的药物用于静脉注射，因其颗粒极其微小，可顺利通过人体最细的毛细血管而不会造成血管堵塞，用于皮下注射时有利于药物集中于注射部位，并使药物释放。微囊化技术应用于中药制剂，使其具有缓释和靶向的特点，提高生物利用度，减少了非药用部位的毒性，提高了中药的疗效和安全性。传统口服药或静脉注射药物在生物体内代谢较快，疗效低，并且具有一定的毒副作用，因此需频繁使用来提高药物的生物利用度。药物释放系统以药物性质为基础，依附合理的载体，可以保护药物活性，延长药物在病灶处的作用时间，实现长期稳定的药物释放，从而提高药效。纳米囊的制备方法主要有嵌段共聚物法和相转移法、乳化聚合法、界面聚合法和界面沉积法。新藤黄酸为代表的酸性黄酮类化合物是藤黄的主要活性物质，具有广谱抗癌作用，对多种肿瘤细胞包括宫颈癌，胆管癌，肝癌，乳腺癌，胃癌，膀胱癌，胶质母细胞瘤和骨肉瘤细胞等有显著的抑杀作用，然而由于藤黄酸的不稳定性与水溶性差，传统剂型诸如注射液或硼酸水溶液的血浆半衰期极短，这使得其抗癌作用与生物利用度受到了极大的限制。采用相转移法制备的新藤黄酸类脂纳米囊，不仅可以增加药物的溶解度，还能制备新抗癌药物剂型，制备方法简便，制剂粒径分布均匀，载药量和包封率效果都很好，为新药开发提供了新的方向。紫杉醇两亲性嵌段共聚物纳米囊经过实验表明比原药的抑瘤率大。实验研究发现，随着载药量的增加，粒径增大，释放速度减慢。海藻酸钠(sa)和壳聚糖微囊以其无毒性、良好的生物相容性、良好的生物可降解性已被广泛应用于药物控释，并取得了一定的进展。

10、壳聚糖(cs)为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，由葡萄糖胺和n-乙酰葡糖胺组成的聚阳离子多糖，具有生物降解性、生物相容性、无毒性、抑菌、增强免疫等多种生理功能，是具有发展前途的多糖类天然高分子材料。壳聚糖可以通过络合和离子交换等作用吸附蛋白质、氨基酸、核酸和其他物质，它的生物相容性和可降解性是非常优异的，且降解后的产物无毒性、无免疫原性。

11、近年来出现了研究中药有效成分聚合物胶束制备的热潮，其中研究最多的是抗肿瘤中药，以紫杉醇最多，也有学者研究了葛根素、穿心莲内酯、姜黄素、五味子素等，主要以包封率和载药量以及释放度作为质量控制指标。

12、脂质体由脂质双分子层组成，内部为水相的闭合囊泡。由于脂质体的结构类似生物膜，故又称人工生物膜，特点是不容易被识别和排斥。脂质纳米材料的膜结构跟细胞膜非常接近，为药物递送和吸收提供了方便，因此，脂质体可以将有效成分包裹后导入细胞，让有效成分轻易进入细胞。脂质体有淋巴趋向性、主动和被动靶向性、物理和化学靶向性等。脂质体可以用于包封不稳定的药物，如青霉素g等，目前我国仅有3个纳米脂质体药物制剂获得批准文号，分别是注射用紫杉醇脂质体、盐酸多柔比星脂质体、注射用两性霉素b脂质体，都是注射用药且主要应用于癌症治疗。王赫等用逆相蒸发法制备芦荟大黄素纳米脂质体(ae-l)，实验结果显示ae-l介导的光动力疗法(pdt6)能够抑制cal-27细胞增殖，且呈光照时间依赖性。abd el-fattah等将槲皮素、磷脂酰胆碱和胆固醇以摩尔比(1:2:0.2)采用薄膜水化法制备成载槲皮素磷脂复合物脂质纳米粒(q-nps)，粒径70nm电位44.6mv，包封率98.4％。纳米脂质体通常需要支撑冻干剂，使用前加生理盐水制成脂质体混悬液。新藤黄酸为代表的酸性黄酮类化合物是藤黄的主要活性物质，具有广谱抗癌作用，对多种肿瘤细胞包括宫颈癌，胆管癌，肝癌，乳腺癌，胃癌，膀胱癌，胶质母细胞瘤和骨肉瘤细胞等有显著的抑杀作用，然而由于藤黄酸的不稳定性与水溶性差，传统剂型诸如注射液或硼酸水溶液的血浆半衰期极短，这使得其抗癌作用与生物利用度受到了极大的限制，将藤黄酸制成脂质体纳米制剂，可以避开其上述缺点。

13、纳米混悬液即纳米晶，是20世纪90年代发展起来的药物直接在稳定剂的存在下通过某种技术直接分散在水中形成的一种稳定的混悬给药体系。药物的纳米结晶化具有载药量高、减少甚至避免使用增溶剂等技术特点。混悬剂属于热力学不稳定的粗分散体系，剧毒药不适合制成混悬液。纳米混悬剂药物粒径小、比表面积大，对黏膜的黏附性较强，可延长药物在胃肠道的滞留时间，提高生物利用度。制备方法主要有乳化法、研磨法、高压匀质法、沉淀法和酸碱反应法。研磨法是指药物粒子经过研磨粉碎得到结晶的方法，该方法使用比较多，且技术比较成熟；高压均质法是通过高速震荡、剪切、对流碰撞制备纳米混悬液，不仅适用于难溶于水的药物，也适用于难溶于有机溶剂的药物，但不适用于多糖类粘度高的药物。酸碱反应法只用于溶解度有酸碱度依赖性的难溶性药物，不使用有机溶剂所以基本不存在溶剂残留的问题，大大提高了药物的安全性。

14、纳米中药主要通过design expert软件box-behnken设计拟合出最优处方并在实验中进行调整，质量控制主要有载药量、包封率、多分散指数、释放度和释放速率以及毒性等，获得一套较为成熟的制备方法，可以申请专利一项，体外研究发现该纳米粒相比dmdd原药对hk-2细胞的影响更好。

15、纳米粒的包封率可达到99％，但是载药量较低，普遍在5％左右，极少能超过20％，纳米制剂的有机溶剂残留、泄漏、突释也是有待解决的问题；许多项目停留在制备以及体外实验，体内实验甚至临床应用也应该取得进展，才能获得实质性成果。中药纳米制剂的开发可以丰富中药试剂品种，满足临床需求，改良剂型也利于中药的传承与发展。中药纳米制剂开发具有很好的前景，剂型改良新药开发成功率高成本低，值得深入研究，争取产业化生产。

16、随着中药药理研究及临床应用的进展，发现中药在抗癌、抗血栓、抗炎、安眠、提高免疫力以及治疗亚健康等方面作用突出。将中药制成种类丰富的纳米制剂，不仅可以减少药物毒性，改善溶解度，提高易挥发药物保留时间，提高生物利用度、扩大临床作用、丰富给药途径，满足精细化、个性化的临床应用需要，让中药充分发挥其优势，还有利于提高国际认可进而扩大中药市场。此外，中药制剂改良促进传统中药与时俱进传承，满足现代医疗需要，具有深远意义。该纳米技术作为新兴技术，应用于中药开发应用具有广阔的前景。

技术实现思路

0、技术实现要素：

1、针对目前2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮(dmdd)溶解度不高、生物利用度不好的问题，本发明提供了杨桃根提取物纳米制剂及其在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述的杨桃根提取物纳米制剂是一种纳米药物载体，用离子交联法将dmdd制备成dmdd壳聚糖纳米粒(dmdd-cs-tpp-nps)，利用响应面法优化dmdd-cs-tpp-nps的制备工艺，递送dmdd，并对其制备条件、结构表征和治疗糖尿病肾病的体外作用进行研究，为递送难溶性药物dmdd提供新思路。

2、本发明的技术路线：

3、本发明通过把dmdd纳米化，制成纳米粒，考察其体外对hk-2细胞的影响，进而研究其体外改善糖尿病肾病的作用。本发明以壳聚糖为载体，采用用离子交联、冷冻干燥干燥技术制备壳聚糖dmdd纳米粒，通过药学研究及相关的制备方法和制剂工艺考察，建立一套制备dmdd纳米粒的有效方法，进一步进行了体外药效学研究和初步安全性评价，从而为开发新型的抗糖尿病民族药提供科学依据。本发明成功制备出了质量可靠、安全稳定的dmdd-cs-tpp-nps，方法可行，改善了dmdd溶解度差的问题，制备的dmdd-cs-tpp-nps体外作用结果显示，该纳米粒安全性较大，浓度低于24μg/ml可以促进hk-2细胞增殖，此外可以促进e-cadherin的表达，抑制vimentin以及tgf-β1表达，效果比dmdd好，对改善糖尿病肾病具有深入研究的意义。

4、本发明的目的通过以下技术方案实现：

5、杨桃根提取物纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：

6、1)空白纳米粒壳聚糖-三聚磷酸钠-纳米粒(空白纳米粒cs-tpp-nps)的制备：

7、精密称取100.0mg壳聚糖(cs)，50.0mg三聚磷酸钠(tpp)，cs加入到100ml含1％的冰乙酸的超纯水中，磁力搅拌1h至cs完全溶胀，用0.45μm滤器过滤备用，分别用1mol/lnaoh溶液和95％(v/v)冰乙酸上调和下调cs溶液的ph值；

8、tpp用超纯水溶解成1％(v/v)tpp溶液，用0.22μm滤器过滤备用；

9、cs-tpp-nps制备：精密量取滤好的cs溶液10ml置于烧杯中，磁力搅拌器500r/min搅拌，用1ml无菌注射器将tpp溶液缓慢滴入cs溶液中，直至可观察到淡蓝色的丁达尔现象之后再磁力搅拌30min，用0.22μm滤器过滤2次，即得到空白纳米粒cs-tpp-nps溶液；

10、2)载药纳米粒dmdd-壳聚糖-三聚磷酸钠-纳米粒(载药纳米粒dmdd-cs-tpp-nps)的制备：

11、将dmdd溶于无水乙醇，超声30s，配成4mg/mldmdd溶液备用；

12、移液枪取滤好的cs溶液10ml置于烧杯中，用1ml无菌注射器缓慢将0.75ml dmdd溶液滴入cs溶液中(1ml/5min)，同时用磁力搅拌器500r/min搅拌10min，之后用注射器将tpp溶液缓慢滴加至上述cs-dmdd混合溶液中(5s/1滴)，溶液呈淡黄蓝色后，再搅拌30min至溶液澄清透明，可观察到丁达尔现象，之后用0.22μm滤器过滤两次，得到载药纳米粒dmdd-cs-tpp-nps溶液，即得到杨桃根提取物纳米制剂。

13、本发明还涉及上述杨桃根提取物纳米制剂在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。

14、和现有技术相比，本发明具有如下优点：

15、本发明所述的杨桃根提取物纳米制剂，通过把dmdd纳米化，制成纳米粒，进而观察其改善糖尿病肾病的作用。本发明以壳聚糖为载体，采用用离子交联、冷冻干燥干燥技术制备壳聚糖dmdd纳米粒，通过药学研究及相关的制备方法和制剂工艺考察，建立了一套制备dmdd纳米粒的有效方法，进一步进行了体外药效学研究和初步安全性评价，从而为开发新型的抗糖尿病民族药提供科学依据；成功制备出质量可靠安全稳定的dmdd-cs-tpp-nps，方法可行，改善了dmdd溶解度差的问题，制备的dmdd-cs-tpp-nps体外作用结果显示，该纳米粒安全性较大，浓度低于24μg/ml可以促进hk-2细胞增殖，此外可以促进e-cadherin的表达，抑制vimentin以及tgf-β1表达，效果比dmdd好。