用于细菌和病毒抗原的基于纳米结构的载体系统的制作方法

背景技术：

1、在疫苗领域，用于确定其组成和制剂的最重要的策略之一是所选抗原呈递至宿主免疫系统的方式。

2、抗原的稳定性、抗原的免疫原性效力以及这些抗原赋予宿主的免疫记忆是共同影响确定给定疫苗的最佳组成和制剂的关键参数。所有这些参数的定义取决于抗原的物理化学特性，因此没有单一明确的策略可以很好地适合不同性质的抗原，即作为一些示例的蛋白质抗原或碳水化合物抗原或糖肽抗原。

3、有效地将抗原输送给哺乳动物免疫系统的现代策略是使用脂质体包埋抗原，所述抗原然后被有效地呈递至免疫系统。这些基于胶束的系统通常由尺寸维度在20-200nm数量级的纳米结构所表示，并且在最近的covid-19大流行中对于正确地向人免疫系统输送各种有效的基于蛋白亚基和基于mrna的疫苗具有至关重要的帮助。

4、然而，这些现代疫苗载体技术还不能被认为已经完全实现了某些免疫特性，即它们无法绕过免疫系统的早期滞后阶段以立即对给定的抗原作出反应，因为疫苗形式施用的新抗原缺乏抗原印记，宿主的免疫系统中不存在这种抗原的免疫记忆。因此，至少需要两/三个疫苗剂量才能建立适当的免疫、t细胞依赖性记忆。

5、在疫苗干预至关重要的医疗情况下还迫切需要疫苗的即时免疫原性，因为这在紧急情况下是需要的。

6、这种显著的疫苗即时免疫原性的缺乏导致covid-19大流行中随着时间的推移在暴露于病毒攻击的人群中延迟保护性抗体的水平，尽管全球范围内实施了大规模免疫接种运动，但在人群中的群体免疫力也变得大大推迟。

7、在covid-19大流行期间，在人群中达到持续的igg抗体介导的特异性免疫应答的免疫潜伏期需要在4至6周的时间间隔内至少两次注射可用的几种疫苗中的任一种。此外，即使在正常的公共卫生条件下，达到疫苗接种方案的最高效率也具有实用和社会价值，这一点在如今大流行后的情况中也可以看到，其中只有一部分符合条件的人口接种了单独一剂疫苗，而大多数人口甚至往往没有接种增强针(例如：美国2022年第四季度记录的有关covid-19免疫接种的公开数据显示，总人口中有68％接种了单剂疫苗，但只有这一百分比中的一半接种了单剂强化)。在处于大流行爆发的紧急情况下或群体免疫力必须被尽快评估的大流行后的情况下时，立即地提供给宿主免疫系统针对入侵病原体的强化的可能性对于控制感染的传播极其重要。

8、这些实验观察促使本技术人去重新思考给定抗感染疫苗可以被正确地以最合适的组成配制的方式，以克服目前存在于新型疫苗的免疫原性活性中的由于抗原特异性免疫记忆在宿主中的缺乏而施加的限制。

9、根据上述，本技术人转而考虑被称为脂质a-saep(合成抗内毒素肽)复合物(美国专利号5,652,211，以biosynth的名义)的基于胶束的系统，命名为类内毒素a(endotoxoida)，作为高度稳定的胶束系统，其尺寸在10-100nm范围内，这里发现其允许在相互作用强疏水力的基础上掺入各种细菌和病毒抗原。根据对生物相关聚合物的iupac术语(2012)，此类尺寸符合纳米粒子的定义范围。另外，类内毒素a的大小尺寸和分子特征类似于大多数致病病毒的大小尺寸和分子特征，并且这一观察结果暗示申请人，哺乳动物免疫系统可以具有更多的可能性将其靶向作为用于疫苗使用的外来抗原，同时也有可能作为被包裹至这种类内毒素a结构的抗原的载体。

10、增强给定疫苗的免疫原性性质的进一步探索在之后与嵌入至类内毒素a纳米结构的抗原的某些特征相关联，在类内毒素a纳米结构中至少一种此类抗原可作为辅助性t细胞依赖性实体作用，用于当这种抗原与普遍用于在个体早期生命中建立抗原特异性印迹的儿科疫苗中存在的一种或多种抗原发生抗原交叉反应时，立即触发在宿主免疫系统上的增强活性，该活性之后伴随该人受试者终身。

11、从以上考虑来看，申请人发现类内毒素a可以成为一种通用系统，用于以可以触发任何个体中的即时(或增强)免疫反应的方式搭载任何种类的抗原，该个体针对这种基于类内毒素的载体系统的抗原成分之一是“抗原致敏(antigenically primed)”的，从而绕过免疫系统的初始滞后阶段，该阶段需要“抗原训练”，然后才能对病毒和细菌性质的新抗原产生有效和特异性的免疫反应。

技术实现思路

1、总的来说，本发明涉及一种为设计亚单位疫苗而开发的新概念，该疫苗专注于由辅助性t细胞依赖性载体蛋白携带的不同病毒和细菌表达的功能性抗原的构象表位以触发人类体免疫系统的即时增强，宿主的免疫力通过抗载体特异性抗体的血清学存在而针对该辅助性t细胞依赖性载体蛋白被普遍致敏(即，当宿主的免疫系统因儿科年龄中的dpt疫苗接种而对白喉毒素/类毒素致敏时，在vs的组成中使用载体蛋白crm197)。该目标通过向这些杂合多能抗原赋予获得载体蛋白的辅助性t细胞依赖性特征的特性(其通过用于模仿病毒纳米颗粒的形状和尺寸特征的纳米结构载体脂质a-saep复合物(即类内毒素a)有意呈递给人类或动物宿主的免疫系统)来实现。

2、因此，本发明的目的是纳米结构的载体系统，其包含掺入至少一种辅助性t细胞依赖性载体抗原的复合脂质a-saep或脂质a衍生物-saep衍生物(类内毒素a)。相对于由dpt引发的普遍致敏，所述t细胞依赖性载体抗原具有上述报告的抗原特征。

3、根据本发明的优选实施方案，所述辅助性t细胞依赖性载体抗原是辅助性t细胞依赖性载体蛋白，其选自由crm197、白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳类毒素或其组合组成的组。可替代地，其相关的rdna蛋白衍生物可被使用。

4、可替代地，通过利用rdna技术以替代众所周知的经典过程获得其相关的蛋白质抗原，该经典过程包括：1)发酵天然细菌菌株；2)纯化分泌的细菌毒素；以及最后；3)通过化学变性方法(例如，甲醛处理)对这种细菌毒素进行解毒。例如，通过rdna技术在多种细菌细胞中获得的蛋白质crm197(交叉反应物质197)是由野生物种的白喉杆菌(c.diphtheriae)分泌的白喉毒素的具有抗原交叉反应但无毒的版本。

5、根据本发明的纳米结构的载体系统的另一个可替代实施方案，脂质a衍生物选自r-lps、r/s-lps或s-lps化学型，并且saep衍生物是线性或环状构象的阳离子和两亲性肽结构，其中阳离子和疏水性氨基酸之间的比率≥0.5。

6、根据本发明的纳米结构的载体系统的另一个优选实施方案，脂质a衍生物-saep衍生物是类内毒素a。

7、在本发明的优选实施方案中，辅助性t细胞依赖性载体蛋白是crm197，因为人免疫系统在生命的早期阶段通过由小儿dpt疫苗接种诱导的抗白喉抗体的血清学存在而针对白喉毒素/类毒素被普遍致敏。

8、crm197是与白喉毒素和类毒素具有免疫原性交叉反应的辅助性t细胞依赖性蛋白，其可与细菌和/或病毒抗原一同掺入纳米结构的载体系统中，从而为将所携带的抗原呈递至哺乳动物的免疫系统提供有效的策略并且触发立即的细胞和体液免疫应答。

9、该免疫学性质是通过利用载体蛋白crm197来实现的，crm197是良好建立的人糖缀合物疫苗的辅助性t细胞依赖性载体，已知其在所有年龄范围都非常有效，并且特别是在免疫系统仍不成熟的人类婴儿(2-6个月大)中以及在由于年龄较大所以免疫系统减弱的老年人群(>65岁)中。

10、特此公开了用于提供即时免疫学“增强”效应的搭载多种抗原的原理，该原理在于，由于用dt和dtp(白喉、破伤风、百日咳)疫苗的儿科疫苗接种，人群几乎普遍对抗白喉类毒素致敏。因此，作为与白喉毒素/类毒素交叉反应的抗原的蛋白质crm197可以作为完美的辅助性t细胞依赖性载体蛋白，将其掺入所公开的纳米结构的载体系统(vs)的制剂，以用于以适当分子组合物的形式施用时，在将第一剂此类抗原给予哺乳动物宿主之后就针对所携带的抗原/半抗原提供强大的“增强”作用。

11、根据进一步的实施方案，病毒抗原属于sars-cov-2病毒的刺突糖蛋白的亚基(即s1或s2亚基)之一。在优选实施方案中，病毒抗原是sars-cov-2的刺突糖蛋白中的s1亚基的受体结合结构域。

12、根据本发明的纳米结构的载体系统可以进一步以缀合或未缀合形式掺入一种或多种细菌和/或病毒抗原。

13、掺入类内毒素a系统的胶束中的细菌和病毒抗原可以是天然分子实体(例如：纯化的蛋白质，如衍生自白喉或破伤风或百日咳生物体的蛋白质、天然糖蛋白和衍生的复合碳水化合物)以及合成的和半合成的分子实体(例如：缀合糖蛋白、合成肽、合成脂肽、合成脂糖)。

14、在本发明的优选实施方案中，细菌抗原可包含以缀合或未缀合形式的荚膜多糖和/或脂多糖。

15、根据本发明的优选实施方案，病毒抗原是病毒构象依赖性抗原。这些可选自包含以下的组：包膜糖蛋白e同型二聚体；rsv灌注f糖蛋白或含有rsf三聚体的其抗原构象位点phi；糖蛋白gp120的外结构域表位；ha、na、np和m1抗原；狂犬病糖蛋白三聚体rabv-g；糖蛋白三聚体ebov。

16、纳米结构的载体系统可掺入以缀合或未缀合形式的病毒抗原。

17、待掺入的细菌和/或病毒抗原的量是当施用至哺乳动物宿主(包括人宿主或兽医)时用于诱导免疫应答的有效量。

18、在本发明的优选实施方案中，细菌和/或病毒抗原与辅助性t细胞依赖性载体抗原或蛋白质缀合。优选地，辅助性t细胞依赖性载体蛋白是crm197。

19、目标是通过赋予这些杂合多能抗原获得载体蛋白crm197的辅助性t细胞依赖性特征的性质来实现的，所述载体蛋白crm197通过纳米结构的载体脂质a-saep复合物(类内毒素a)有目的地呈递给人或动物宿主的免疫系统，用于模拟病毒纳米颗粒的形状和大小特征。

20、本发明的纳米结构的载体系统还可包括已知的免疫佐剂。这种免疫佐剂可以是矿物来源的佐剂诸如明矾和/或铝盐，如氢氧化铝/磷酸盐和硫酸铝钾，以及现代疫苗学中使用的生物学性质的佐剂。

21、根据可替代的实施方案，根据本发明的纳米结构的载体系统可包含杂合分子构建体(以下也称为杂合抗原)，其包含携带一种或多种属于sars-cov-2病毒的病毒抗原的辅助性t细胞依赖性载体蛋白。

22、这些杂合抗原可通过组分的化学反应或通过使用重组dna技术产生。

23、根据本发明的优选实施方案，所述杂合抗原包含共价地结合至病毒蛋白的生物学功能亚基的crm197，该病毒蛋白的生物学功能亚基是三聚体融合前状态的受体结合结构域(rbdt)，是sars-cov-2病毒的刺突糖蛋白中的s1亚基的一部分。这种分子构建体的目标是实现杂合的、多能的、纳米结构的抗原，该抗原能够表达针对三聚体rbd(三聚体构象中的受体结合结构域，rbdt，作为s蛋白的亚单位s1中存在的融合前结构)的免疫增强活性，因为其在已经由蛋白质抗原(例如：白喉类毒素)致敏的哺乳动物宿主中的首次注射与作为此类杂合抗原的结构的一部分的蛋白质抗原(例如：crm197)发生交叉反应并用作辅助性t细胞依赖性载体。

24、根据免疫系统的这一基本特性，公开了杂合缀合抗原crm197-rbdt的制备和免疫原性性质。这种缀合物能够在其作为原型疫苗的首次剂量后立即增强哺乳动物的dt致敏的免疫系统，这是尽早实现抗cov-2免疫的尚未满足的特征。事实上，从covid-19病理学上的临床经验和所引入的第一代mrna疫苗中了解到，第一剂疫苗引发适度水平的促炎细胞因子(例如干扰素同种型)，这需要几天达到峰值，使免疫系统对第二剂的快速反应做好准备，第二剂在几天内引发干扰素的立即且急剧的释放，同时伴随着特异性针对病毒刺突糖蛋白的igg同种型抗体的对数增加。据报道，第一剂量和第二剂量后的干扰素特征都与特异性igg抗体反应的发展有关。在患有covid-19的患者中也观察到这种独特的干扰素反应表型，并且与病理学严重程度相关，最终与重症监护持续时间的差异相关。

25、因此，作为本发明的优选实施方案，在此公开的杂合crm197-rbdt抗原旨在通过使用具有内置辅助性t细胞依赖性特征的设计的抗原来提供在免疫应答窗口中的该间隙时间的消除，因为宿主的背景免疫学记忆已经存在，所述抗原被掺入作为纳米颗粒系统的纳米结构的类内毒素a中，通过模拟病毒颗粒的表面向宿主的免疫系统提供最佳的抗原呈递。

26、本发明进一步提供了掺入杂合抗原的纳米结构的载体系统的产生方法，其包括以下步骤：

27、(1)在适当的还原条件和然后在氧化条件下，根据以下反应化学计量使所述辅助性t细胞依赖性载体蛋白crm197与所述病毒抗原rbd反应以形成共价链间s-s交联键：

28、3crm197(-sh)2+2rbdt(-sh)3

29、以产生具有式crm1973rbd2的杂合抗原；

30、(2)将在步骤1)中获得的所述杂合抗原掺入类内毒素a的脂质a部分，导致纳米颗粒的形成。

31、本发明进一步涉及由此获得的具有式crm1973rbd2及其因数或倍数的杂合抗原。由于这些产物是分子多分散体，因此涉及杂合抗原的术语倍数旨在涵盖代表性化合物(crm1973rbd2)n的多指数。

32、本发明进一步涉及上述公开的纳米结构的载体系统，用于在医学领域中用作疫苗，以用于当施用至哺乳动物宿主(包括人类宿主或兽医)时诱导免疫应答。

33、本发明的进一步目的是提供一种疫苗，其包含纳米结构的载体系统，该纳米结构的载体系统包含掺入辅助性t细胞依赖性载体蛋白的复合脂质a-saep或脂质a衍生物-saep衍生物(类内毒素a)，其用于对哺乳动物宿主进行针对病毒和/或细菌感染的疫苗接种，所述疫苗任选地包含其他药学上可接受的佐剂。

34、根据目前对免疫系统的了解，向宿主施用疫苗将改变这种宿主的免疫系统中的一个或多个特定靶标，随后出现免疫应答。

35、可利用该载体系统通过将载体系统与一种或多种不同物种特异性的构象依赖性病毒抗原组合制备疫苗，所述病毒抗原为例如表达构象(四级)表位或部分表位的包膜糖蛋白e同型二聚体，作为用于登革热2病毒的疫苗；或者病毒抗原是稳定的rsv灌注f糖蛋白，或其含有呼吸道合胞病毒(rsv)的rsf三聚体的抗原构象位点phi；或者病毒因子是与人类广谱中和抗体结合的处于其天然构象下的糖蛋白gp120的外部结构域表位，作为用于hiv的疫苗。其他病毒构象依赖性抗原包括处于其各自的天然构象下的流感病毒的多种抗原中的至少一种(ha、na、np和m1)，作为用于流感病毒(iv)的疫苗；或者狂犬病的病毒抗原是表达功能性四级表位的融合前构象状态的狂犬病糖蛋白三聚体rabv-g，作为用于狂犬病病毒(rv)的疫苗；或者病毒抗原是表达埃博拉病毒(ebov)的功能性表位的融合前构象状态的糖蛋白三聚体ebov。这些疫苗可以掺入缀合或非缀合形式的病毒因子。

36、如果疫苗针对物种特异性的细菌，抗原可以包括缀合或非缀合形式形式的荚膜多糖或脂多糖。

37、还可使用载体系统以单价或多价制剂(用于预防多重耐药病原体)形式制备针对物种特异性抗原的疫苗，所述抗原为例如荚膜多糖和/或脂多糖，例如埃希氏菌属(例如大肠杆菌(e.coli))、沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌(s.typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium))、志贺氏菌属(例如弗氏志贺氏菌(shigella flexneri)和宋内氏志贺氏菌(shigella sonnei))、克雷伯菌属(例如肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae))、假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa))、不动杆菌属(例如鲍曼不动杆菌(a.baummannii))、梭状芽孢杆菌属(例如艰难梭菌(clostridium difficile))和葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus))的荚膜多糖和/或脂多糖。

38、可制备多重载体系统以制造具有多种物种特异性抗原的广谱疫苗。这些疫苗可以与基于糖缀合物的疫苗(例如gsk或pfizer)一起配制，以制备针对革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌的广谱物种特异性疫苗。

39、包含纳米结构的载体系统的本发明疫苗可配制用于哺乳动物宿主中的胃肠外(i.m，s.c.，i.p.)和局部施用(i.n.)。

40、根据优选实施方案，根据本发明的基于vs的疫苗以0.1-100μg，优选1-50μg的范围内的有效量施用。

41、本发明还包括制备载体系统的方法，其包括将脂质a-saep或脂质a衍生物saep(类内毒素a)与辅助性t细胞依赖性载体蛋白以及免疫原性量的细菌和/或病毒抗原组合。所述细菌和/或病毒抗原可与所述辅助性t细胞依赖性载体蛋白缀合和/或不缀合。

42、本发明还涉及一种制备载体系统的方法，其包括将脂质a-saep或脂质a衍生物-saep与缀合的杂合抗原组合，所述缀合的杂合抗原包括crm197蛋白和由任何所关注的sarscov变体(voc)以单体或三聚体构象表达的病毒sars cov-2-s蛋白或所述蛋白中被称为rbd(受体结合结构域)的部分。

43、缀合的杂合抗原可以与佐剂一起配制成物种特异性疫苗。

44、杂合抗原可以配制成用于预防covid-19的物种特异性疫苗，其基于包含crm197的载体系统和由任何sars cov-2voc以单体或三聚体构象表达的sars cov-2-s蛋白或rbd的组合。