一种磁性共价有机骨架材料及其制备方法和应用

本发明涉及生化分析，特别涉及一种用于细胞外囊泡分离的磁性共价有机骨架材料及制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是由细胞释放到细胞外空间的具有磷脂双分子层结构的膜性囊泡，其在介导细胞间通讯、调节生物学过程、作为药物的载体和疾病的潜在诊断标志物等方面发挥重要作用。在众多evs的研究中，其关键步骤之一是建立高效的分离方法。然而，evs通常存在于非常复杂的体液样品中，与尺寸和密度接近的杂质颗粒共存，导致其分离难度极大。

2、近年来，一系列有效的evs分离方法被相继报道，如作为标准方法的超高速离心法，其可以处理大量样本，但其受限于需要大型且昂贵的仪器，操作繁琐耗时(～10h/次)，机械力损伤evs结构导致其活性丧失、产率和纯度低等；尺寸排阻色谱法和聚合物沉降法虽然产率高、价格低、操作简单，但其选择性差，纯度低，无法分离特定的evs亚群；基于免疫磁珠的方法可以实现evs亚群的特异性分离富集，但由于磁珠分散性差、抗体负载量低的限制，导致其分离效率低、耗时长。因此，建立简便、高效、高纯度evs分离方法，对促进evs的研究具有重大意义。

3、共价有机骨架材料(covalent organic framework material,cofs)是通过较强可逆共价键连接有机单体合成的一类晶态多孔的聚合物材料。由于其结构特征，此类材料具有骨架密度低、比表面积大、孔径可调、物理化学性质稳定、有机单体可修饰等特点。cofs材料独特的结构特性使其在前处理介质、吸附和催化等领域显示出巨大的潜力。磁性cofs材料(magnetic covalent organic framework,mcofs)具有特殊的磁响应性、选择性、重复利用性和方便洗脱等特点，并且在大的比表面积中赋予了更多的结合位点，使其在样品前处理应用中成为了一种优良的吸附材料，能够很好地实现对目标分析物选择性分离富集，极大地促进分析技术向简单、快速、高效、低成本等方向发展。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种磁性共价有机骨架材料、其制备方法以及在细胞外囊泡高效分离上的应用；该磁性共价有机骨架材料包含有核壳结构的磁性共价有机骨架及结合在其表面的膜联蛋白，可以实现对细胞外囊泡的高效且高选择性的分离；其中的核壳结构的磁性共价有机骨架通过增加磁性纳米材料的活性羧基基团，一方面提高磁性纳米材料的水相分散性，另一方面提高对膜联蛋白的负载率，从而提高evs的分离效率。

2、为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明一方面提供了一种磁性共价有机骨架材料，其包括核壳结构的磁性共价有机骨架及结合在其表面的膜联蛋白；所述核壳结构的磁性共价有机骨架的制备方法为：先将磁性氨基功能化fe3o4纳米颗粒与2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯进行缩合反应，再将2,5-二氨基对苯二甲酸与修饰到fe3o4纳米颗粒上的2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯进行缩合反应，获得核壳结构的磁性共价有机骨架纳米颗粒。

4、进一步的，所述2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯是利用二甘醇酸酐与三醛基间苯三酚合成得到，其分子结构式为式(ⅰ)所示：

5、

6、本发明另一方面提供了一种磁性共价有机骨架材料的制备方法，包括如下步骤：

7、(1)制备得到磁性氨基功能化fe3o4纳米颗粒与2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯；

8、(2)通过氨基和羧基的缩合反应，将2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯修饰到磁性氨基功能化fe3o4纳米颗粒上；

9、(3)通过2,5-二氨基对苯二甲酸与修饰到fe3o4纳米颗粒上的2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯的缩合反应对fe3o4纳米颗粒进行包裹，获得核壳结构的磁性共价有机骨架纳米颗粒；

10、(4)通过共价交联作用在核壳结构的磁性共价有机骨架纳米颗粒表面修饰膜联蛋白v。

11、进一步的，磁性氨基功能化fe3o4纳米颗粒的制备过程为：

12、将29.97mmol fecl3、5.10mmol柠檬酸三钠和146.29mmol醋酸钠溶解于溶剂中，然后将混合液转入高压反应釜中加热，冷却后经洗涤干燥得到磁性fe3o4纳米颗粒；

13、将150mg磁性fe3o4纳米颗粒超声分散至溶剂中，加入1.2ml氨水和100μl正硅酸乙酯，搅拌反应；再将制得的产物分散于溶剂中，加入0.5ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应后得到磁性氨基功能化fe3o4纳米颗粒。

14、进一步的，2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯是利用二甘醇酸酐与三醛基间苯三酚合成得到。

15、进一步的，2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯的具体制备过程为：

16、将1.2mmol二甘醇酸酐和0.01mmol三醛基间苯三酚分别分散于10ml无水四氢呋喃溶剂中，在惰性气体氛围下，将三醛基间苯三酚分散液滴加到二甘醇酸酐溶液中，于一定温度下将混合物回流冷凝，冷却后加水以使反应物悬浮，然后蒸发溶剂，经洗涤干燥得到2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯。

17、进一步的，步骤(2)的具体方法为：将75mg磁性氨基功能化fe3o4纳米颗粒分散于溶剂中，加入5mg 2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯和75μl乙酸，将混合物超声处理，然后转移到高压釜中，并在一定的温度下加热反应，分离产物后再经洗涤干燥，得到修饰产物；

18、步骤(3)的具体方法为：将0.1mmol 2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯、0.15mmol2,5-二氨基对苯二甲酸和步骤(3)得到的59mg修饰产物分别溶于溶剂中，再将溶液转移到高压釜中于一定温度下加热反应，分离产物后再经洗涤干燥，得到核壳结构的磁性共价有机骨架纳米颗粒。

19、进一步的，步骤(4)的具体方法为：先在核壳结构的磁性共价有机骨架纳米颗粒上修饰链酶亲和素，然后利用链霉亲和素-生物素的亲和作用将生物素化的膜联蛋白v修饰到磁性共价有机骨架纳米颗粒上。

20、本发明还提供了以上所述的磁性共价有机骨架材料在细胞外囊泡分离或在制备细胞外囊泡分离产品中的应用。

21、本发明进一步提供了该磁性共价有机骨架材料在捕获分离类风湿关节炎生物标志物evs中的应用。

22、本发明的有益效果是：

23、本发明合成了一种新型的富含-cooh活性位点的高亲水性新型磁性cofs材料，并在其上修饰膜联蛋白v，实现对细胞外囊泡高效且高选择性的分离。具体的，本发明首先分别合成富含氨基的fe3o4纳米颗粒和单体2,4,6-三羧基-1,3,5-三甲酰基苯(ctp)，然后利用氨基与羧基的缩合反应将ctp修饰到fe3o4表面，再通过2,5-二氨基对苯二甲酸与ctp的缩合作用下将fe3o4包裹，合成具有核壳结构的磁性共价有机骨架纳米颗粒(mctppa)，再通过共价交联作用在mctppa表面修饰膜联蛋白v。

24、本发明通过增加磁性纳米材料的活性羧基基团，一方面提高磁性纳米材料的水相分散性，另一方面使得磁性共价有机骨架拥有足够多的修饰位点，提高了对膜联蛋白的负载率，从而提高evs的分离效率。材料所负载的膜联蛋白v可以实现对evs的高选择性捕获，提高所捕获的evs的纯度。

25、总而言之，相比于现有技术，本发明具有以下优点：

26、a.操作更简单；只需磁性分离，无需大型的离心机等设备；

27、b.分离更高效；采用分散性更好、活性位点更多的磁性共价有机骨架材料负载膜联蛋白v，其效率更高。

28、c.耗时更短(仅需1h)，条件温和，可实现evs的无损释放；

29、d.成本更低；材料可多次重复利用，降低成本。