一种提取分离高纯度外泌体的方法与流程

本发明属于外泌体分离提取，具体涉及一种提取分离高纯度外泌体的方法。

背景技术：

1、外泌体是由细胞分泌的具有膜结构的囊泡，直径在40~160nm之间，内含多种核酸、蛋白质、脂质等成分，在细胞间的通讯发挥重要作用。外泌体具有良好的耐受性和生物相容性、较低免疫原性、可以穿越天然屏障、可进行工程化改造等诸多优势，目前已作为递送载体被广泛应用在心血管疾病、肾损伤、免疫疾病、神经系统疾病和癌症等多种疾病的治疗研究中。

2、外泌体的分离提取方法包括超速离心、超滤和尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀、免疫亲和层析等。目前，超速离心是外泌体分离的“金标准”，但这个方法通常需要超过100000g的离心力，而且分离操作复杂且周期长。超滤和尺寸排阻色谱法都是根据外泌体尺寸进行分离的方法。超滤是将样品通过具有不同孔径的膜过滤器，根据颗粒的大小和分子量进行分离。尺寸排阻色谱也是根据颗粒的大小进行分离的，较大的颗粒先离开色谱柱被分离出来，而较小的颗粒较晚离开因此被收集。聚合物沉淀是通过添加聚乙二醇，将外泌体在溶液中形成沉淀，再通过1500g低速离心，使外泌体得以分离，该方法适用于大量样本，但所得外泌体纯度较低。免疫亲和层析是根据外泌体表面特有的抗原分子，使其与抗体相结合而被分离出来，该方法特异性强但产量较低，且难以从样品中完全除去抗体。

3、近来，有研究表明，利用电荷原理通过离子交换层析填料可以提取外泌体，此方法可使用简单的离心机设备进行外泌体提取，然而，发明人在研究时发现，通过离子交换层析填料虽然可以提取到细胞上清、尿液中的外泌体，但是电镜结果显示所得外泌体背景中存在大量杂质，这对外泌体的实际使用显然是不利的。

技术实现思路

1、针对通过离子交换填料提取的外泌体中存在大量杂质的问题，本发明提供了一种提取纯化外泌体的方法，该方法简单且有效。

2、本发明的技术方案具体如下所示：

3、一种提取分离高纯度外泌体的方法，包括以下步骤：

4、s1、取样品依次经过离心、过滤以得到无大颗粒杂质的上清；

5、s2、用离子交换层析填料吸附上清中的外泌体，再用洗脱液进行洗脱；

6、s3、将所得外泌体溶液加入装填mixq700s填料的离心柱中，离心所得滤过液即为高纯度外泌体溶液。

7、在本发明方法中，步骤s1中的样品具体为细胞培养液、尿液等生物体液。发明人对经过离子交换层析填料提取的外泌体进行鉴定分析后，发现电镜显示外泌体背景中的杂质多呈现为晶体小颗粒，进一步分析发现其包含盐粒子及其他非外泌体蛋白；发明人通过大量试验探索，发现仅利用装填mixq700s填料的离心柱通过简单低速离心即可去除有效外泌体中的杂质，且鉴定所得电镜图背景干净。mixq700s为一种复合模式填料，其中填料粒径为70um，核壳结构微球，壳层为中性亲水层，可阻止700kd以上的蛋白进入内部，核层为阴离子交换和疏水作用功能层，常用来分离纯化蛋白。

8、优选地，在上述方法中，步骤s1中的离心条件为1500-3000g离心10-20min，过滤则是采用0.22μm孔径滤膜对离心上清液进行过滤。本发明方法先通过离心去除样品中的大颗粒杂质，再通过过滤除去非外泌体大囊泡和大部分杂蛋白；样品经过这些前处理，就可以得到无大颗粒杂质的上清，利于后续吸附、洗脱。

9、优选地，在上述方法中，步骤s2具体为：将离子交换层析填料、上清于结合缓冲液中孵育后，离心并将沉淀转移至纯化柱中，用洗涤液进行洗涤，再用洗脱液进行洗脱。

10、优选地，在上述方法中，步骤s2中离子交换层析填料为弱阴离子交换层析填料，其中弱阴离子交换剂包括二乙胺基乙基。

11、更优选地，在上述方法的步骤s2中，结合缓冲液为200-500mm tris-hcl缓冲液（ph7.0-8.0），洗涤液为50-200mm tris、10-150mm nacl（ph 7.2-8.0），洗脱液为50-100mmhepes、100-500mm nacl。

12、优选地，在上述方法中，步骤s3的离心条件为：300-1000g离心30-90s。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

14、针对利用离子交换层析填料吸附作用，提取分离外泌体过程中的杂质问题，本发明创新地引入了自填装mixq700s填料的离心柱，且通过简单的离心操作即可达到完全去除杂质的效果。

技术特征：

1.一种提取分离高纯度外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1样品包括细胞培养液、尿液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1所述离心为：1500-3000g离心10-20min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1过滤采用0.22μm孔径滤膜。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2具体为：将离子交换层析填料、细胞上清于结合缓冲液中孵育后，离心并将沉淀转移至纯化柱中，用洗涤液进行洗涤，再用洗脱液进行洗脱。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤s2所述离子交换层析填料为弱阴离子交换层析填料，其中弱阴离子交换剂包括二乙胺基乙基。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述结合缓冲液为ph 7.0-8.0，200-500mm tris-hcl。

8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述洗涤液为ph 7.2-8.0，50-200mmtris、10-150mm nacl。

9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述洗脱液为ph 7.2-7.5，50-100mmhepes、100-500mm nacl。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3所述离心为：300-1000g离心30-90s。

技术总结本发明公开了一种提取分离高纯度外泌体的方法，包括以下步骤：取样品依次经过离心、过滤以得到无大颗粒杂质的上清；用离子交换层析填料吸附上清中的外泌体，再用洗脱液进行洗脱；将所得外泌体溶液加入自装MixQ700S填料的离心柱中，离心所得滤过液即为高纯度外泌体溶液。本发明创新地引入了自填装MixQ700S填料的离心柱，仅通过简单的离心操作即可达到完除杂质的效果，且所得外泌体完整性好。本发明方法简单易操作，并能够获取纯度高的外泌体，对外泌体的下游应用具有重要意义。技术研发人员：李立,吴笛笛,刘丕菊,甘宁,高小艳,滕兆伟,赵睿明,张静受保护的技术使用者：珈泌生物科技（武汉）有限责任公司技术研发日：技术公布日：2024/9/26