一种可控的规模化制备细胞球体的方法及应用与流程

本发明涉及生物材料，具体涉及一种可控的规模化制备细胞球体的方法及应用。

背景技术：

1、通常情况下肿瘤细胞平面培养不仅是体外研究各类细胞行为的重要工具，还在药物筛选与评估等方面发挥着关键作用。这种培养体系中，细胞能在塑料或玻璃表面生长，同时培养液为细胞提供必要的养分，从而维持其活性。这种研究方法极大地推动了生物学和医学的边界拓展。

2、然而，尽管肿瘤细胞平面培养操作简单，但其局限性也显而易见。这种方法无法准确模拟细胞在体内复杂的微环境，以及细胞间的信号传递、生化过程和几何学改变等复杂生物学过程。因此，通过肿瘤细胞平面培养获得的数据在应用于体内研究时，可能会带来误导和不可预测性。

3、为了克服这些局限，研究人员纷纷将目光投向肿瘤细胞三维培养技术，这是一种更为接近细胞真实生长环境的体外培养方法。目前，有多种三维细胞培养方法可供选择，包括无基质胶支架法和基质胶支架法。然而，现有的这些方法在制备细胞球体方面仍存在诸多不足，如难以实现规模化制备、耗材昂贵或操作复杂等。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种可控的规模化制备细胞球体的方法及应用，能很好地模拟肿瘤组织的立体结构和功能，可用于研究肿瘤的发病机理、筛选药物和优化治疗方案。

2、本发明采用的技术解决方案是：一种可控的规模化制备细胞球体的方法，包括以下步骤：

3、（1）将细胞培养基、可溶性微载体和肿瘤细胞悬液加入到细胞培养容器中；

4、（2）在细胞培养容器中进行细胞培养，培养细胞至其覆盖整个可溶性微载体表面；

5、（3）使用溶解剂对可溶性微载体进行溶解，获得所需的多细胞肿瘤球体。

6、作为优选，所述的肿瘤细胞为人源或动物源贴壁肿瘤细胞系、正常人或小鼠的组织分离获得的贴壁细胞系、或患者或小鼠的肿瘤组织中贴壁细胞中的一种或多种。

7、作为优选，所述的细胞培养容器为低粘附性细胞培养容器，包括细胞培养皿、细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养转瓶、细胞培养滚瓶、或细胞培养生物反应器。低粘附性细胞培养容器是指不容易让贴壁细胞贴附在其内表面的玻璃或塑料材质容器，比如康宁®超低附着细胞培养瓶。

8、作为优选，所述的可溶性微载体为可酶降解微载体。

9、作为优选，所述的可酶降解微载体为交联多糖微载体。

10、作为优选，所述的交联多糖微载体为选自葡聚糖、纤维素、果胶、胶原、明胶、胶原蛋白、聚半乳糖醛酸、海藻酸、透明质酸、以及它们的衍生物中的一种或几种多糖组合交联制备而成。

11、作为优选，所述的交联多糖微载体通过以下步骤制备：将多糖溶液、不与水互溶的有机溶剂和乳化剂的液体进行处理形成油包水乳液，添加交联剂，使多糖发生交联反应；

12、或者先在多糖溶液中添加交联剂使多糖发生交联反应，再将交联后的多糖溶液、不与水互溶的有机溶剂和乳化剂的液体进行处理形成油包水乳液。

13、作为优选，所述的步骤（1）中加入的可溶性微载体的尺寸取决于所需制备的多细胞肿瘤球体的尺寸大小。

14、作为优选，所述的溶解剂为与交联多糖对应的多糖酶。

15、作为优选，所述的步骤（3）中使用溶解剂对可溶性微载体进行溶解的时机为在可溶性微载体表面贴壁生长的肿瘤细胞在微载体表面汇合度达到50%以上时。

16、作为优选，所述的步骤（3）中使用溶解剂对可溶性微载体进行溶解的具体步骤为：加入与交联多糖对应的多糖酶在4-37℃条件下，孵育20-30分钟即可完全溶解。

17、作为优选，还包括以下步骤：获得所需的多细胞肿瘤球体继续培养而使细胞球体的直径增加。

18、一种制备的细胞球体在制备体外筛选抗肿瘤药物的体系上的应用。

19、作为优选，所述的体系中将用于筛选的抗肿瘤药物直接添加到细胞球体体系中，在处理时间点观察细胞球体直径变化、细胞活性、药物渗透情况判断药物的体外杀伤作用。

20、作为优选，所述的抗肿瘤药物为细胞治疗药物、抗体药物、溶瘤病毒药物、抗体偶联（adc）药物或免疫毒素药物。

21、本发明的有益效果是：本发明提供了一种可控的规模化制备细胞球体的方法及应用，利用可溶性多糖微载体在生物反应器中培养多种贴壁肿瘤细胞，从而制备多细胞肿瘤球体，多细胞肿瘤球体中包含一种或多种肿瘤细胞，细胞数目一般在数十个以上，能很好地模拟肿瘤组织的立体结构和功能，细胞球体的尺寸大小可取决于葡聚糖微载体的尺寸，这使得该方法具有极高的灵活性，本发明实现了一种操作简单、低成本且高效率的多细胞肿瘤球体规模化制备方法，为体外药物筛选和评估等领域提高效率降低了成本。

技术特征：

1.一种可控的规模化制备细胞球体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞为人源或动物源贴壁肿瘤细胞系、正常人或小鼠的组织分离获得的贴壁细胞系、或患者或小鼠的肿瘤组织中贴壁细胞中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞培养容器为低粘附性细胞培养容器，包括细胞培养皿、细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养转瓶、细胞培养滚瓶、或细胞培养生物反应器。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可溶性微载体为可酶降解微载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的可酶降解微载体为交联多糖微载体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的交联多糖微载体为选自葡聚糖、纤维素、果胶、胶原、明胶、胶原蛋白、聚半乳糖醛酸、海藻酸、透明质酸、以及它们的衍生物中的一种或几种多糖组合交联制备而成。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的交联多糖微载体通过以下步骤制备：将多糖溶液、不与水互溶的有机溶剂和乳化剂的液体进行处理形成油包水乳液，添加交联剂，使多糖发生交联反应；

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中加入的可溶性微载体的尺寸取决于所需制备的多细胞肿瘤球体的尺寸大小。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的溶解剂为与交联多糖对应的多糖酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中使用溶解剂对可溶性微载体进行溶解的时机为在可溶性微载体表面贴壁生长的肿瘤细胞在微载体表面汇合度达到50%以上时。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中使用溶解剂对可溶性微载体进行溶解的具体步骤为：加入与交联多糖对应的多糖酶在4-37℃条件下，孵育20-30分钟即可完全溶解。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：获得所需的多细胞肿瘤球体继续培养而使细胞球体的直径增加。

13.一种权利要求1所述的制备方法制备的细胞球体在制备体外筛选抗肿瘤药物的体系上的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的体系中将用于筛选的抗肿瘤药物直接添加到细胞球体体系中，在处理时间点观察细胞球体直径变化、细胞活性、药物渗透情况判断药物的体外杀伤作用。

15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为细胞治疗药物、抗体药物、溶瘤病毒药物、抗体偶联（adc）药物或免疫毒素药物。

技术总结一种可控的规模化制备细胞球体的方法及应用，利用可溶性多糖微载体在生物反应器中培养多种贴壁肿瘤细胞，从而制备多细胞肿瘤球体，多细胞肿瘤球体中包含一种或多种肿瘤细胞，细胞数目一般在数十个以上，能很好地模拟肿瘤组织的立体结构和功能，细胞球体的尺寸大小可取决于葡聚糖微载体的尺寸，这使得该方法具有极高的灵活性，本发明实现了一种操作简单、低成本且高效率的多细胞肿瘤球体规模化制备方法，为体外药物筛选和评估等领域提高效率降低了成本。技术研发人员：夏玉龙,陈尚武,郑景,吴雅彬,郑杰受保护的技术使用者：国科温州研究院（温州生物材料与工程研究所）技术研发日：技术公布日：2024/9/26