一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法与流程

本发明涉及布洛芬对映体浓度检测，尤其涉及一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法。

背景技术：

1、布洛芬，又称异丁苯丙酸，是一种广泛使用于临床的非甾体抗炎药，在解热、镇痛、抗炎方面发挥着重要作用。布洛芬结构中含有一个手性中心，可将其拆分为左旋布洛芬与右旋布洛芬。临床常用的布洛芬为消旋体，含有等量的右旋布洛芬与左旋布洛芬，右旋布洛芬为主要发挥药理活性的优势对映体，但左旋布洛芬可在机体内手性转化为右旋布洛芬，因此，分别对左、右旋布洛芬进行定量有重要意义。建立快速、灵敏、简便易操作的检测全血样品中左、右旋布洛芬药物浓度的方法，并将验证后的方法应用于km小鼠灌胃给药消旋布洛芬的药代动力学研究十分重要。因此需要一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术问题而提出的一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明包括以下步骤：

4、s1、制备消旋布洛芬储备液和制备内标溶液；

5、s2、获得全血样品；

6、s3、构建左、右旋布洛芬在全血样本中的标准曲线；

7、s4、取全血样品5μl，加入沉淀剂含1.3%甲酸的乙腈进行蛋白沉淀后进行lc-ms/ms分析；

8、s5、通过所述标准曲线对所述全血样品进行定量，通过插值计算，得到全血样品中左、右旋布洛芬的浓度。

9、进一步地，步骤s1中，制备消旋布洛芬储备液：精密称定标准品消旋布洛芬，用二甲基亚砜配制储备液浓度为2/2mg/ml。

10、进一步地，在步骤s1中，制备内标溶液：布洛芬杂质80使用二甲基亚砜配制为2mg/ml的储备液，精密量取储备液，用乙腈逐步稀释成浓度为50μg/ml的内标溶液备用。

11、进一步地，在步骤s2中，全血样品的获得：km小鼠6只，给药前12h禁食；灌胃给药消旋布洛芬，给药剂量为100mg/kg于给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h由静脉窦采血20μl置于含edtak2的抗凝管中，于-70℃冰箱存放待测。

12、进一步地，在步骤s3中，用体积比1：1的甲醇和水稀释成系列浓度的布洛芬标准品工作溶液，分别取各浓度工作溶液5μl于5μl空白全血中，使得全血中左、右旋布洛芬终浓度分别为0.04/0.04μg/ml，0.1/0.1μg/ml，0.5/0.5μg/ml，2.5/2.5μg/ml，10/10μg/ml，25/25μg/ml，70/70μg/ml，80/80μg/ml，涡旋30s，加入10μl的所述内标溶液和40μl乙腈（含1.3%甲酸），涡旋90s，离心处理10min，取40μl上清液加入40μl超纯水，涡旋后进行lc-ms/ms分析，以左、右旋布洛芬血药浓度为横坐标，待测物与内标峰面积之比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得直线回归方程即为标准曲线。

13、进一步地，在步骤s4中，全血样品处理：取步骤s2中全血样品5μl，加入5μl甲醇，涡旋，加入10μl步骤s1中的内标溶液和40μl乙腈（含1.3%甲酸），涡旋90s，离心处理10min，取40μl上清液加入40μl超纯水，涡旋后进行lc-ms/ms分析。

14、相比现有技术，本发明的有益效果为：

15、本发明避免了萃取、浓缩等繁琐操作，提高了样品处理效率，简便快捷，灵敏度高，基质效应小；本方法采血量极少，仅使用一只小鼠便可完成一条药-时曲线，并在小鼠全血中完成了布洛芬对映体的拆分，本检测方法验证结果显示准确可靠，回收率高。

技术特征：

1.一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法，其特征在于，步骤s1中，制备消旋布洛芬储备液：精密称定标准品消旋布洛芬，用二甲基亚砜配制储备液浓度为2/2mg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法，其特征在于，在步骤s1中，制备内标溶液：布洛芬杂质80使用二甲基亚砜配制为2mg/ml的储备液，精密量取储备液，用乙腈逐步稀释成浓度为50μg/ml的内标溶液备用。

4.根据权利要求1所述的一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法，其特征在于，在步骤s2中，全血样品的获得：km小鼠6只，给药前12h禁食；灌胃给药消旋布洛芬、给药剂量为100mg/kg于给药后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h由静脉窦采血20μl置于含edtak2的抗凝管中，于-70℃冰箱存放待测。

5.根据权利要求1所述的一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法，其特征在于，在步骤s3中，用体积比1：1的甲醇和水稀释成系列浓度的布洛芬标准品工作溶液，分别取各浓度工作溶液5μl于5μl空白全血中，使得全血中左、右旋布洛芬终浓度分别为0.04/0.04μg/ml，0.1/0.1μg/ml，0.5/0.5μg/ml，2.5/2.5μg/ml，10/10μg/ml，25/25μg/ml，70/70μg/ml，80/80μg/ml，涡旋30s，加入10μl的所述内标溶液和40μl乙腈，涡旋90s，离心处理10min，取40μl上清液加入40μl超纯水，涡旋后进行lc-ms/ms分析，以左、右旋布洛芬血药浓度为横坐标，待测物与内标峰面积之比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，所得直线回归方程即为标准曲线。

6.根据权利要求1所述的一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法，其特征在于，在步骤s4中，全血样品处理：取步骤s2中全血样品5μl，加入5μl甲醇，涡旋，加入10μl步骤s1中的内标溶液和40μl乙腈，涡旋90s，离心处理10min，取40μl上清液加入40μl超纯水，涡旋后进行lc-ms/ms分析。

技术总结本发明公开了一种检测极微量全血样品中布洛芬对映体的手性拆分方法，包括制备消旋布洛芬储备液和内标溶液；获得全血样品；构建左、右旋布洛芬在全血样本中的标准曲线；取全血样品5μL，进行蛋白沉淀后注入LC‑MS/MS分析；通过所述标准曲线对所述全血样品进行定量，通过插值计算，得到全血样品中左、右旋布洛芬的浓度。本发明避免了萃取、浓缩等繁琐操作，提高了样品处理效率，采血量极少，仅使用一只小鼠便可完成一条药‑时曲线，简便快捷，灵敏度高，基质效应小。技术研发人员：李敬来,李悦新,阮志鹏,刘诗琦,罗欢,杨缓缓受保护的技术使用者：国科卓越（北京）医药科技研究有限公司技术研发日：技术公布日：2024/9/26