一种人发角蛋白抗菌材料及其制备方法和应用

本发明涉及生物医用高分子，尤其涉及一种人发角蛋白抗菌材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、抗生素耐药性已经成为一个全球性的问题。其产生的一个重要原因是抗生素抗菌机制单一，使得细菌很容易发生基因突变来对抗抗生素。因此，开发具有多种抗菌机制的抗菌材料已成为一种颇具潜景的解决这一难题的思路。

2、季铵盐是一种阳离子抗菌剂，其带正电荷的“头”能附着在细菌膜的极性表面上，从而取代了其中的mg2+和ca2+阳离子，而其亲脂性的“尾巴”则嵌入到磷脂双分子层中。这导致细胞膜失去了流动性，进而造成膜的分裂。因此季铵盐的抗菌作用可以从两方面得以体现：一是通过静电作用与带负电的细菌细胞膜结合，造成细胞膜的破坏，抑制细菌生长；另一方面，它还能防止表面生物膜的形成，而细菌也难以对季铵盐产生耐药性。

3、在应用中，通过对蛋白质织物进行处理引入季铵基团可以提高织物的抗菌性能。例如公开号为cn104831533a的中国发明专利提供了一种使蛋白质织物表面具有抗菌及抗静电性能的处理方法，使用三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，tcep)在室温下处理蛋白质织物，使蛋白质纤维所含的角蛋白中的二硫键断裂形成巯基；然后通过点击化学反应，使2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(glycidyl trimethyl ammonium chloride，gtac)中的环氧结构与经过tcep处理的蛋白质织物表面上的巯基共价结合；经过处理的蛋白质织物具有良好的抗菌及抗静电性能。该发明的主要应用场景为织物的处理，而在生物医用领域中，抗菌材料通常需要具备良好的水溶性及较小的尺寸，以在生物细胞层面发挥杀菌功能，这是上述方案难以实现的；同时，抗菌材料还需要满足较低的生物毒性，减少正常细胞的凋亡，而季铵盐的生物毒性较高，一定程度上也阻碍了它的应用。

4、除季铵盐外，银纳米簇也是一种具有良好抗菌性能的材料，其抗菌机制包括对细菌膜的损伤、金属离子释放、活性氧(reactive oxygen species，ros)的产生、胞内成分破坏等。将二者有效结合在一起有望获得更加优良的抗菌效果。然而，将两种或多种具有不同抗菌机制的抗菌组份结合在一起，往往需要一个载体。该载体可以不具有抗菌功效，但也应具备高效负载能力和持久的稳定负载时间。因此，一种合格的载体材料应具备以下性质：官能团丰富、良好的生物相容性、生物降解性和生物安全性。

5、例如公开号为cn109202098a的中国发明专利则提供了一种角蛋白复合银纳米簇的制备方法，采用以下步骤：(1)将角蛋白溶液与硝酸银溶液混合并调节ph值；(2)加入硼氢化钠溶液并静置反应30min；(3)通过纯化方法终止反应，制备得到荧光银纳米簇。该方案提供了于角蛋白表面引入银纳米簇的技术方案。因此，以角蛋白为载体，使用tcep处理角蛋白引入季铵基团，随后利用上述方案制备银纳米簇得到双抗菌组分的材料，可能是得到满足生物医用需求的抗菌材料的可行方向。

6、人体毛发角蛋白是一种从头发中提取的蛋白质，而在日常生活中，头发往往因缺乏有效利用途径而作为理发行业等的垃圾浪费，与上述发明采用如羊毛等动物来源的纤维相比更加经济低廉。因此发明人尝试以头发作为角蛋白载体来源，引入季铵基团及银簇制备目标抗菌材料。然而在人发提取角蛋白载体以负载季铵基团及银簇的过程中，同样存在亟需解决的新技术难点。现有技术采用tcep对羊毛织物角蛋白进行处理，使二硫键还原为巯基即可达到处理目的，由于作为织物的使用性质，其无需考虑角蛋白提取及溶解性的问题。而基于本发明的实际用途，需将角蛋白从相比羊毛纤维更紧密的人发中提取出来，并满足可溶性要求，使其在溶液环境下进行处理。在此过程中，角蛋白的溶解和稳定是关键。

7、综上所述，提供一种切实可行的方案，以人发提取的可溶性人发角蛋白为载体，实现季铵基团和银簇的复合并得到抗菌材料，并同时满足杀菌性、生物相容性的需求，具有重要的应用价值和意义。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，在本发明的第一方面，提供了一种操作简便、稳定性佳的人发角蛋白抗菌材料的制备方法，包括如下步骤：

2、(1)角蛋白的提取：

3、对头发进行预处理，将预处理所得头发与三(羟甲基)氨基甲烷(tris碱)、硫脲、表面活性剂、三(2-羧乙基)膦、乙醇、水混合，调节体系的ph为9-10，配置形成提取液；惰性气氛下，提取液于一定温度进行反应；反应完成后离心收集上清液，上清液经透析、冷冻干燥，得到絮状的角蛋白；

4、(2)季铵化角蛋白的制备：

5、将所得角蛋白与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵溶于水，调节体系的ph为8.5-9.5，随后于一定温度下进行反应；反应完成后产物经透析、冷冻干燥，得到季铵化角蛋白；

6、(3)人发角蛋白抗菌材料的制备：

7、将所得季铵化角蛋白溶于水形成溶液，向该溶液中加入硝酸银的水溶液，并调节体系的ph为9-10，得到混合溶液；向混合溶液中加入硼氢化钠的水溶液，在避光环境下于一定温度进行反应；反应完成后产物经透析、冷冻干燥，得到银簇@季铵化角蛋白，即人发角蛋白抗菌材料。

8、在实际操作中，回收的头发一般表面残留各类污渍，因此在制备前可通过预处理的方式对其净化，以去除其表面残留的油脂、无机盐等污物，便于后续处理。

9、优选的，所述步骤(1)中，预处理的步骤如下：将头发剪至2-3mm，依次以水、乙醇进行洗涤，随后将初次洗涤后的头发与正己烷混合并处理，随后将头发再次用乙醇、水进行洗涤并干燥。

10、基于头发的实际用量，三(羟甲基)氨基甲烷、硫脲、表面活性剂、三(2-羧乙基)膦的用量适宜控制在合适的范围内，以提高头发中角蛋白的提取量，并降低原料的浪费。

11、优选的，所述步骤(1)中，预处理所得头发的用量为3g；三(羟甲基)氨基甲烷的用量为0.00075-0.003mol；硫脲的用量为0.19-0.76mol；表面活性剂为十二烷基磺酸钠(dodecyl sodium sulfonate，sds)，其用量为0.00875-0.035mol；三(2-羧乙基)膦的用量为0.028-0.083mol；乙醇的用量为10-30ml；水的用量为25-80ml。

12、优选的，所述步骤(1)中，反应的温度为50-70℃，反应时长为24-72h。

13、季铵化角蛋白的季铵化率与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的用量相关。当其添加量在适宜的范围内，可使季铵化率基本达到饱和，提高原料的利用率。

14、优选的，所述步骤(2)中，角蛋白的用量为0.1g；2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的用量为0.05-0.2g；水的用量为10-20ml。

15、优选的，所述步骤(2)中，反应的温度为40-60℃，反应时长为12-48h。

16、本工艺具有良好的灵活性，可以通过改变添加硝酸银和硼氢化钠的量，得到含有不同银含量的银簇@季铵化角蛋白，以满足不同的使用需求。但硝酸银的用量过高时，则会造成所得银簇的粒径较大，进而导致银簇@季铵化角蛋白分散性变差，因此硝酸银的用量宜控制在合适范围内。

17、优选的，所述步骤(3)中，季铵化角蛋白的用量为0.05g；水的用量为10-20ml；硝酸银的水溶液的用量为1-3ml，其中硝酸银的质量为0.003-0.024g；硼氢化钠的水溶液的用量为1-3ml，其中硼氢化钠与硝酸银的水溶液中的硝酸银的质量比为5:6。

18、优选的，所述步骤(3)中，反应的温度为30-50℃，反应时长为12-24h。

19、工艺涉及的ph适宜控制在上述合适的范围内。例如在季铵化制备中，如上偏碱性的环境可以让氨基去质子化，利于氨基与环氧基团的开环加成；而在碱性过强的条件下，会导致目标角蛋白变性，不利于人发角蛋白抗菌材料的制备。本领域技术人员可以按需采用一元强碱，如氢氧化钠或氢氧化钾形成的水溶液来调节各步骤的体系ph至目标范围。

20、优选的，采用一元碱性水溶液调节体系的ph；一元碱性水溶液选自氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。

21、优选的，透析的截留分子量(molecular weight cutoff，mwco)为3.5kda。

22、在本发明的第二方面，提供了一种杀菌性能佳、生物相容性好的人发角蛋白抗菌材料，采用本发明第一方面的方法制备而成。

23、在本发明的第三方面，提供了一种本发明第二方面的人发角蛋白抗菌材料的应用，具体是作为抗菌材料在抑制细菌繁殖或杀菌中的应用。

24、基于以上技术方案，本发明成功实现了由头发中提取目标角蛋白的工艺，并以其为载体负载季铵基团及纳米银簇，为季铵基团与纳米银簇的复合提供了切实可行的技术方案，完成了人发角蛋白抗菌材料的制备。本发明的设计构思及原理在于，在以tcep处理角蛋白的过程中加入硫脲、tris碱及表面活性剂。利用硫脲削弱多肽链内的疏水区域的接触，破坏蛋白分子间的氢键，防止由氢键引起的蛋白质聚集，促进角蛋白内部结构的膨胀，使还原剂更容易接近角蛋白的二硫键并将其转化为巯基，提供更多的修饰位点；由于角蛋白在酸性中性环境中溶解性差，容易发生团聚沉淀，在碱性环境下，通过tris碱稳定溶液的碱性ph值，既在加快头发的溶解同时保证角蛋白中的羧基不被酸化，也避免过高的ph环境造成角蛋白的变性，此外，tris碱还具有抗氧化的功能；并结合表面活性剂，提高水溶液中角蛋白的溶解度和稳定性。采用本方法制备的人发角蛋白抗菌材料白兼具良好的抗菌效果及低生物毒性。

25、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

26、本发明提供了一种人发角蛋白抗菌材料的制备方法，具有操作简便、稳定性佳的优势，适用于量产。

27、本发明提供了一种人发角蛋白抗菌材料，其水溶性好，银簇分散度集中，抗菌效果优异，生物毒性低。

28、本发明提供了一种人发角蛋白抗菌材料的应用，作为抗菌材料可以降低使用抗生素带来细菌抗药性上升的不良影响，可作为安全性好的抗菌剂替代品，具有良好的应用价值。