SERPINH1基因条件性点突变动物模型的构建方法

本发明属于生物医学，具体涉及serpinh1基因条件性点突变动物模型的构建方法。

背景技术：

1、骨质疏松症是以骨量减低，骨组织微结构损坏，导致骨强度下降，容易发生骨折为特征的全身性骨骼疾病。骨质疏松症是受遗传和环境等多因素调控的复杂疾病，其关键发病机制是骨转换失衡。骨转换受多条信号通路的精密调控。近年来对罕见疾病的研究为常见骨骼疾病的发病机制和治疗，提供了非常有益的研究线索。

2、成骨不全症作为最常见的单基因遗传性骨病，是研究骨质疏松性骨折的天然疾病模型。基因工程动物模型的建立和应用极大促进了对人类疾病机理和治疗的探索，对于生命科学和基础医学的发展具有里程碑式的意义。serpinh1双等位基因全身敲除动物模型会出现胚胎致死的现象，而条件性基因突变的打靶策略不仅能避免全基因敲除引起的胚胎致死及表型复杂等问题，而且能够精准地评估基因在特定组织和器官中的功能和调控作用。目前，未有serpinh1基因条件性突变的动物模型的报道。而人类serpinh1基因编码的hsp47蛋白与大鼠及小鼠的hsp47蛋白同源性高达93％以上，提示大、小鼠等哺乳动物可作为serpinh1基因突变的理想研究对象。所以，亟需在与人类遗传同源性高度相似的动物中构建成骨不全症的疾病模型，以深入研究骨折高风险发生的遗传学机制、建立以serpinh1基因调控骨转换关键信号通路为靶点的诊疗新策略。另一方面，serpinh1基因除了在研究骨骼代谢的遗传学调控方面具有重要价值外，其在肿瘤、自身免疫病及糖尿病等的发病中也具有关键作用，本发明提供的动物模型在上述疾病研究中也具有重要的潜在应用价值。

技术实现思路

1、为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种serpinh1基因条件性点突变动物模型的构建方法和应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面提供了一种用于serpinh1基因编辑的sgrna，所述sgrna的序列如seq id no:3-6所示。

4、进一步，所述sgrna还包括与sgrna相关的生物材料。

5、进一步，所述生物材料选自如下任一种：

6、(1)编码所述sgrna的核酸分子；

7、(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒；

8、(3)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表达盒的重组载体；

9、(4)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表达盒或(3)所述重组载体的重组微生物；

10、(5)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

11、(6)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表达盒的转基因动物组织；

12、(7)含有(1)所述核酸分子或(2)所述表达盒的转基因动物器官。

13、本发明的第二方面提供了一种用于serpinh1基因编辑的系统，所述系统包括本发明第一方面所述的sgrna。

14、本发明的第三方面提供了一种serpinh1基因条件性点突变动物模型的构建方法，所述方法包括改变正常动物的serpinh1基因，使serpinh1基因的第62位的丙氨酸突变为缬氨酸。

15、进一步，所述方法包括如下步骤：

16、s1.体外转录sgrna；

17、s2.构建cas9打靶载体和donor载体；

18、s3.将cas9打靶载体、sgrna及donor载体导入到受体细胞，获得f0代动物；

19、s4.测序验证阳性的f0代动物交配获得纯合f1代serpinh1flox/flox动物，与cre动物杂交获得serpinh1基因条件性点突变动物模型；

20、进一步，所述cre动物为cre哺乳动物。

21、进一步，所述cre哺乳动物为cre大鼠。

22、进一步，所述cre大鼠为bglap-cre大鼠。

23、进一步，所述bglap-cre大鼠构建所用的sgrna序列如seq id no:20-23所示。

24、进一步，步骤(1)中sgrna为本发明第一方面所述的sgrna。

25、进一步，所述动物为哺乳动物。

26、进一步，所述哺乳动物包括大鼠、小鼠。

27、进一步，所述哺乳动物选自大鼠。

28、进一步，所述大鼠为sd大鼠。

29、进一步，步骤(3)中的受体细胞为受精卵。

30、进一步，步骤(3)中的导入方式为显微注射。

31、本发明的第四方面提供了本发明第二方面所述的系统在构建serpinh1基因条件性点突变模型中的应用。

32、进一步，所述的模型包括细胞模型、动物模型。

33、进一步，所述动物模型选自哺乳动物模型。

34、进一步，所述哺乳动物模型包括大鼠模型、小鼠模型。

35、进一步，所述大鼠模型为sd大鼠模型。

36、本发明第五方面提供了本发明第三方面所述的方法构建得到的serpinh1基因条件性点突变动物模型在筛选用于预防和/或治疗成骨不全症/骨质疏松的候选药物中的应用。

37、本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的sgrna的如下任一项应用：

38、(1)在构建serpinh1基因突变的模型中的应用；

39、(2)在研究成骨不全症和/或骨质疏松症中的应用；

40、(3)在研究肿瘤疾病中的应用；

41、(4)在研究自身免疫疾病中的应用；

42、(5)在研究糖尿病中的应用。

43、进一步，(1)中所述的模型包括细胞模型、动物模型。

44、进一步，所述动物模型选自哺乳动物模型。

45、进一步，所述哺乳动物模型包括大鼠模型、小鼠模型。

46、进一步，所述大鼠模型为sd大鼠模型。

47、本发明的优点和有益效果：

48、本发明首次提供了serpinh1基因条件性点突变大鼠模型及其构建方法和应用。本发明方法构建的大鼠模型弥补了骨折高风险遗传相关动物模型的不足，为研究骨折高风险的遗传调控新机制提供了可靠、有效的实验动物模型，为成骨不全症、骨质疏松症预防、诊断以及治疗新策略的建立提供了良好的动物基础，具有重要的应用价值。此外，本发明在肿瘤、糖尿病及自身免疫性疾病等方面也具有潜在的应用价值。

技术特征：

1.一种用于serpinh1基因编辑的sgrna，其特征在于，所述sgrna的序列如seq id no:3-6所示。

2.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna还包括与sgrna相关的生物材料；

3.一种用于serpinh1基因编辑的系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1或2所述的sgrna。

4.一种serpinh1基因条件性点突变动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括改变正常动物的serpinh1基因，使serpinh1基因的第62位的丙氨酸突变为缬氨酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中sgrna为权利要求1或2所述的sgrna。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述动物为哺乳动物；

8.权利要求3所述的系统在构建serpinh1基因条件性点突变模型中的应用；

9.权利要求4-6任一项所述的方法构建得到的serpinh1基因条件性点突变动物模型在筛选用于预防和/或治疗成骨不全症/骨质疏松的候选药物中的应用。

10.权利要求1或2所述的sgrna的如下任一项应用：

技术总结本发明公开了SERPINH1基因条件性点突变动物模型的构建方法。本发明首次提供了SERPINH1基因条件性点突变大鼠模型及其构建方法和应用。本发明方法构建的大鼠模型弥补了骨折高风险遗传相关动物模型的不足，为研究骨折高风险的遗传调控新机制提供了可靠、有效的实验动物模型，为成骨不全症、骨质疏松症预防、诊断以及治疗新策略的建立提供了良好的动物基础，具有重要的应用价值。此外，本发明在肿瘤、糖尿病及自身免疫性疾病等方面也具有潜在的应用价值。技术研发人员：李梅,林小云,胡静受保护的技术使用者：中国医学科学院北京协和医院技术研发日：技术公布日：2024/10/10