一种谷氨酸脱氢酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，具体而言，涉及一种谷氨酸脱氢酶突变体及其在合成l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸中的应用。

背景技术：

1、草铵膦(2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸)是许多商业化除草剂的活性成分，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，其有两种光学异构体，分别为l-草铵膦及d-草铵膦，仅有l-草铵膦具有除草活性。

2、l-草铵膦(即l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸)的制备方法主要有化学合成法及生物转化法。化学合成法存在反应条件苛刻、反应步骤长、产物ee值(对映体过剩率，即enantiomeric excess)低、收率低等问题，逐渐被取代。生物转化法具备特异性高、绿色环保、反应条件温和及产物分离纯化等优点，目前已经受到了广泛的关注。

3、目前，现有技术报道多条l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸的生物法合成路线，例如，中国专利cn110343676a对源于croynebacterium glutamicum的谷氨酸脱氢酶进行定点突变，与野生型酶相比，获得的突变体能够催化更高浓度的底物，酶的作用效率有明显提高。

4、尽管现有技术中的l-谷氨酸脱氢酶活性有明显提高，但是其选择的l-谷氨酸脱氢酶均为nadph依赖型，nadph价格昂贵，且需要添加葡萄糖脱氢酶及辅助底物葡萄糖，实现nadph的循环再生，生成副产物葡萄糖酸，这增加了原料成本及产物分离纯化的难度，因此，选择一种副产物易分离、原料成本低的l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸制备方法迫在眉睫。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种谷氨酸脱氢酶突变体及其在合成l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸中的应用，该谷氨酸脱氢酶突变体能够提高其转化ppo制备l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸的效率，并将其与甲酸脱氢酶(fdh)偶联，实现辅酶nadh的循环再生。

2、本发明是这样实现的：

3、本发明合成l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸的路线如图1所示，其以ppo为底物，在谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶的作用下转化为l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸。为了提高l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸的合成效率，本发明对nadh依赖型的谷氨酸脱氢酶进行定点突变，然后将其与甲酸脱氢酶偶联，实现nadh的循环再生，提高ppo转化为l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸的效率。

4、本发明的谷氨酸脱氢酶突变体是在seq id no.5所示的氨基酸序列的基础上定点突变获得。具体地，谷氨酸脱氢酶突变体的突变位点包括第322位、第378位、第346位、第92位和第165位中的至少一种。

5、其中，第322位的突变方式为：谷氨酰胺突变为谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或丙氨酸中的任意一种，即q322e、q322n、q322d和q322a。

6、第378位的突变方式为：丝氨酸突变为苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸中的任意一种，即s378t、s378a、s378v、s378e和s378d。

7、第346位的突变方式为：天冬酰胺突变为丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸中的任意一种，即n346a、n346s和n346t。

8、第92位的突变方式为：精氨酸突变为赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸或酪氨酸中的任意一种，即r92k、r92p、r92s和r92y。

9、第165位的突变方式为：异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或丝氨酸中的任意一种，即i165v、i165l和i165s。

10、上述第322位、第378位、第346位、第92和第165位的突变能够提高l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸的合成效率，较佳地，谷氨酸脱氢酶突变体的突变方式为q322n、s378d、n346s、r92k和i165l中的任意一种或几种的组合。

11、经过试验证明，当谷氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示时，其转化效果最佳。如seq id no.7所示的氨基酸序列是在seq id no.5所示的氨基酸序列的基础上进行了q322n、s378d、n346s、r92k和i165l五点突变。

12、根据上述谷氨酸脱氢酶突变体可以获得相关的生物材料，其包括：编码上述谷氨酸脱氢酶突变体的核酸分子；含有上述核酸分子的表达盒；含有上述核酸分子的重组载体、或含有上述表达盒的重组载体；含有上述核酸分子的重组菌、或含有上述表达盒的重组菌、或含有上述重组载体的重组菌。

13、在本发明中，编码上述谷氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如seq id no.8所示。

14、将上述谷氨酸脱氢酶突变体与甲酸脱氢酶联用，用于合成l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸。具体地，本发明提供的一种合成l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸的方法包括：将表达上述谷氨酸脱氢酶突变体的重组菌与表达甲酸脱氢酶的重组菌进行破碎，然后将其上清液加入转化体系中反应，获得l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸。

15、在一些实施例中，甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.9所示。

16、在一些实施例中，表达谷氨酸脱氢酶突变体的重组菌与甲酸脱氢酶的重组菌的宿主包括大肠杆菌。

17、在一些实施例中，上述转化体系包括：2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸、甲酸铵、nad+和重组菌体。

18、在一些实施例中，上述转化体系包括：2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸5-150g/l、甲酸铵2-60g/l、nad+0.02-0.2mm、表达谷氨酸脱氢酶突变体的重组菌1-20g/l，表达甲酸脱氢酶的重组菌1-20g/l。

19、在一些实施例中，反应的条件为：ph为6.0-9.0，温度为15-40℃，摇床转速150-250rpm，反应时间1-5h。

20、本发明具有以下有益效果：

21、本发明通过定点突变获得了高活性nadh依赖型谷氨酸脱氢酶突变体，利用谷氨酸脱氢酶突变体与甲酸脱氢酶能够催化底物ppo及甲酸铵合成l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸。通过上述方法能够实现nadh循环再生，生成的副产物二氧化碳易分离，降低了l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸分离纯化的成本；而且本发明的合成方法在2h内能够转化获得119.2g/l的l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸，转化率高达99％，ee值>99％，优于原始酶和其他突变酶的转化效果，具有良好的工业化应用前景。

技术特征：

1.一种谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶突变体是在seq id no.5所示的氨基酸序列的基础上发生突变获得的，所述谷氨酸脱氢酶突变体的突变位点包括：第322位、第378位、第346位、第92位和第165位中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶突变体的突变方式为如下(1)-(5)中的任意一种或几种的组合：

3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶突变体的突变方式为如下(1)-(5)中的任意一种或几种的组合：

4.根据权利要求3所述的谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示。

5.与权利要求1-4任一项所述的谷氨酸脱氢酶突变体相关的生物材料，其特征在于，为以下(1)-(4)中的任意一种：

6.如权利要求1-4任一项所述的谷氨酸脱氢酶突变体或权利要求5所述的生物材料在合成l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸及其衍生物中的应用。

7.一种合成l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸的方法，其特征在于，包括：将表达权利要求1-4任一项所述的谷氨酸脱氢酶突变体的重组菌与表达甲酸脱氢酶的重组菌进行破碎，然后将其上清液加入转化体系中反应，获得l-2-氨基-4-[羟基(甲基)-膦酰基]丁酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列如seq idno.9所示。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，表达所述谷氨酸脱氢酶突变体的重组菌与甲酸脱氢酶的重组菌的宿主包括大肠杆菌。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转化体系包括：2-氧代-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸、甲酸铵、nad+和重组菌体；

技术总结本发明公开了一种谷氨酸脱氢酶突变体及其在合成L‑2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)‑膦酰基]丁酸中的应用，其中谷氨酸脱氢酶突变体是在氨基酸序列SEQ ID NO.5所示谷氨酸脱氢酶的基础上发生突变获得的，突变位点包括：第322位、第378位、第346位、第92位和第165位中的至少一种。通过上述突变获得的谷氨酸脱氢酶突变体与甲酸脱氢酶能够催化底物PPO及甲酸铵合成L‑2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)‑膦酰基]丁酸，并且能够实现NADH循环再生，生成的副产物二氧化碳易分离，降低了L‑2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)‑膦酰基]丁酸分离纯化的成本；本发明的合成方法具有较好的转化效果，因此具有良好的工业化应用前景。技术研发人员：陶福平,叶芳胜,秦勇,杨波受保护的技术使用者：江西唯铂莱生物制药有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10