一种宫缩乏力小鼠模型的构建方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种宫缩乏力小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、子宫肌的收缩功能在妊娠的维持和启动当中起着关键的作用，子宫肌从静息到收缩状态转变的调控机制，以及子宫肌收缩过程中有哪些因子参与调控，目前仍然没有得到彻底的阐明。因为机制的不清除，目前临床上对于早产、宫缩乏力等与子宫肌收缩功能相关的疾病的治疗手段仍旧相对缺乏，难以达到稳定且高效的治疗效果。

2、孕期子宫肌可分为4个阶段：静息期、分娩前的激活期、分娩时的收缩期、产后的复原期。静息期：在妊娠的第36-38周，子宫肌在孕激素和松弛素的状态下处于舒张状态。激活期：在妊娠最后的2-4周，子宫肌由静息期向收缩期过渡并被激活，可以出现弱而不规则的子宫收缩。此时，会出现子宫肌和宫颈结构和功能的明显变化，例如子宫肌细胞间缝隙连接增加，缩宫素和前列腺素受体等收缩相关蛋白大量增加，子宫肌对缩宫素和前列腺素的反应增强以及宫颈软化成熟及子宫下段形成等。收缩期：分娩发动时，子宫肌对缩宫素和前列腺素的敏感性进一步加强，从不规则收缩发展为有节律的强烈收缩。复原期：子宫肌的收缩减弱，逐步向妊娠之前的状态转变。在这大约40周的时间内，子宫肌细胞需要从静息、增殖表型、合成表型等，再到分娩时期的收缩表型的转换。如果表型转换的过程中发生异常，可能导致最终的分娩阶段子宫肌不能维持应有的收缩功能，例如子宫肌过早的收缩，表现为早产，或者子宫肌收缩能力不足，表现为产程延长，宫缩乏力。

3、子宫收缩乏力是产后出血的基础病因，一项大型全球随机对照试验的数据提示子宫收缩乏力占所有产后出血病例的30-80％。目前针对子宫收缩乏力的治疗药物有缩宫素、麦角新碱、米索前列醇等，这些药物的作用有时不够理想，还可能带来一系列心血管影响，包括低血压、心动过速、st段抑制、心肌缺血和心律失常。进一步的治疗方式有子宫按摩，子宫填塞，子宫压缩缝合，但有可能导致宫坏死和宫内粘连。当上述方法失效时，为了挽救生命，可以选择双侧子宫动脉结扎术、髂内动脉结扎术，甚至子宫切除术，这将无法保留正常的生育功能。

4、目前，对于子宫收缩乏力的研究，可以使用野生型小鼠，在小鼠怀孕后临产前，注射药物干预，使得小鼠发生宫缩乏力的表型。但单独给药造模的方式仍然存在局限性，而基因敲除造模可以更好地对子宫收缩乏力进行研究。另外，由于人体实验的医学伦理学制约，动物模型成为研究宫缩乏力发生发展及探索防治措施的重要工具，然而目前尚未有表型稳定且可供大量繁育的宫缩乏力动物模型。因此，本领域需要一种宫缩乏力的动物模型的构建方法。

技术实现思路

1、因此，本发明提供一种宫缩乏力小鼠模型的构建方法，所述方法包括通过特异性敲除小鼠的子宫平滑肌cbs基因，构建宫缩乏力小鼠模型。

2、在一种具体的实施方式中，将loxp序列插入小鼠cbs基因的两端而用于标记并有效敲除cbs基因，得到的在cbs基因的两端插入有loxp序列的小鼠命名为loxp-flox-cbs小鼠，或称为cbsf/f小鼠；之后，将loxp-flox-cbs小鼠与携带tagln-cre酶的工具小鼠相交配并与loxp-flox-cbs小鼠回交纯化，得到所述宫缩乏力小鼠模型，即cbsf/f/tagln-cre小鼠，或称为cbsd/d小鼠；所述tagln-cre酶为平滑肌驱动的cre。

3、在一种具体的实施方式中，得到所述宫缩乏力小鼠模型，即cbsf/f/tagln-cre小鼠后，将模型小鼠cbsf/f/tagln-cre小鼠的雄鼠与对照小鼠cbsf/f小鼠的雌鼠合笼，以繁育更多的模型小鼠cbsd/d小鼠和对照小鼠cbsf/f小鼠。

4、在一种具体的实施方式中，雌雄合笼比例为3:1或以上。

5、在一种具体的实施方式中，在构建小鼠模型的最开始时选择雌性cbsf/f小鼠携带flox序列，而雄性小鼠为携带tagln-cre酶的工具小鼠。

6、本发明中，所述flox序列即loxp序列。

7、在一种具体的实施方式中，所述小鼠为spf级c57bl/6小鼠。

8、本发明还提供一种宫缩乏力小鼠模型的应用，包括所述构建方法制备得到的宫缩乏力小鼠模型用于治疗和/或预防动物和人类宫缩乏力的药物开发。

9、本发明还提供一种筛选用于治疗和/或预防动物和人类宫缩乏力的药物的方法，所述方法包括如下步骤：

10、1)将待测试药物施用于权利要求1～6中任一项所述的构建方法构建得到的小鼠模型中；

11、2)分析待测试药物的治疗效果并进行评价，选择能够明显改善模型小鼠病理特征的测试药物。

12、本发明具有以下有益效果：

13、1、本发明采用小鼠模型模拟人体自然状态进行实验以研究发病机制和治疗，降低了在人体实施实验的必要性，避免了人体实验的伦理纠纷。

14、2、全身敲除cbs将导致小鼠在胚胎时期死亡，本发明通过特异性敲除子宫平滑肌细胞的cbs基因构建宫缩乏力小鼠模型，小鼠存活率高且敲除效率高，构建成功后表型稳定，不会随着时间和交配次数增加而出现症状缓解或消失等情况。

15、3、发明中宫缩乏力模型的病理表现有分娩启动时间推迟，产程延长，子宫肌收缩乏力等表型。与人类宫缩乏力的病理改变相符，能够较好地模拟人体自然疾病状态，有较好的代表性。

16、4、本发明中小鼠模型发生宫缩乏力的表型明显，可以填补目前缺少相关动物模型的空白，有利于观察并设计相关实验和开发相关药物。

17、5、本发明可以从基因、蛋白质、组织器官等多个方面多个角度对基因敲除进行验证和观察，实验结果真实、可信、有说服力。

18、总的来说，本发明通过条件性敲除子宫平滑肌细胞cbs基因，构建宫缩乏力的小鼠模型，该小鼠模型具有分娩启动时间推迟，产程延长，子宫肌收缩乏力等表型，与人类宫缩乏力的症状及病理过程相符，操作可控性好、稳定性佳。本发明的宫缩乏力小鼠模型可用于研究宫缩乏力的发生发展机制及防治措施，以及用于新药的开发和研究。此外，通过条件性基因敲除所构建的小鼠模型，可以进一步系统地探究在妊娠之前以及妊娠早期阶段子宫肌发生转变的分子机制。

技术特征：

1.一种宫缩乏力小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括通过特异性敲除小鼠的子宫平滑肌cbs基因，构建宫缩乏力小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的宫缩乏力小鼠模型的构建方法，其特征在于，将loxp序列插入小鼠cbs基因的两端而用于标记并有效敲除cbs基因，得到的在cbs基因的两端插入有loxp序列的小鼠命名为loxp-flox-cbs小鼠，或称为cbsf/f小鼠；之后，将loxp-flox-cbs小鼠与携带tagln-cre酶的工具小鼠相交配并与loxp-flox-cbs小鼠回交纯化，得到所述宫缩乏力小鼠模型，即cbsf/f/tagln-cre小鼠，或称为cbsd/d小鼠；所述tagln-cre酶为平滑肌驱动的cre。

3.根据权利要求2所述的宫缩乏力小鼠模型的构建方法，其特征在于，得到所述宫缩乏力小鼠模型，即cbsf/f/tagln-cre小鼠后，将模型小鼠cbsf/f/tagln-cre小鼠的雄鼠与对照小鼠cbsf/f小鼠的雌鼠合笼，以繁育更多的模型小鼠cbsd/d小鼠和对照小鼠cbsf/f小鼠。

4.根据权利要求3所述的宫缩乏力小鼠模型的构建方法，其特征在于，雌雄合笼比例为3:1或以上。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的宫缩乏力小鼠模型的构建方法，其特征在于，在构建小鼠模型的最开始时选择雌性cbsf/f小鼠携带flox序列，而雄性小鼠为携带tagln-cre酶的工具小鼠。

6.根据权利要求1～4中任意一项所述的宫缩乏力小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为spf级c57bl/6小鼠。

7.一种宫缩乏力小鼠模型的应用，其特征在于，权利要求1～6中任意一项所述构建方法制备得到的宫缩乏力小鼠模型用于治疗和/或预防动物和人类宫缩乏力的药物开发。

8.一种筛选用于治疗和/或预防动物和人类宫缩乏力的药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

技术总结本发明提供一种宫缩乏力小鼠模型的构建方法，属于生物医药领域，本发明通过特异性敲除子宫平滑肌CBS基因，构建宫缩乏力小鼠模型，该小鼠模型具有分娩启动时间延迟，产程延长，子宫肌收缩乏力的特征性症状，与人类宫缩乏力的症状及病理过程相符，操作可控性好、稳定性佳。本发明所述方法构建的小鼠模型可用于研究宫缩乏力发生发展机制及防治措施，以及用于新药的开发和研究。技术研发人员：倪鑫,罗杰丰,唐政山受保护的技术使用者：中南大学湘雅医院技术研发日：技术公布日：2024/10/10