一种路氏肠杆菌T977及其分离方法和在降解烟叶淀粉的应用与流程

本发明属于微生物降解领域。具体涉及一种路氏肠杆菌t977及其分离方法和在降解烟叶淀粉的应用。

背景技术：

1、淀粉是烟叶中重要的有机化合物，其含量过高会产生焦糊气味以及多种有害成分，对烟草制品的感官质量产生不良影响。相较于国外优质烟叶，中国烟叶淀粉含量普遍偏高。研究表明，一定范围内，烟叶感官质量随淀粉含量的下降而提升，因此利用适宜的方法降解烟叶淀粉对提升烟叶品质具有重要意义。

2、大量研究表明，微生物法降解烟叶淀粉可显著提升烟叶品质。淀粉酶是催化水解淀粉糖苷键的酶类统称，全称为1，4-α-d-葡聚糖水解酶，可分为a-淀粉酶、β-淀粉酶以及γ-淀粉酶。淀粉酶能够催化水解淀粉和糖原，生成葡萄糖、麦芽糖和具有α-1，6-糖苷键支链的糊精，在食品、医药、纺织和饲料等领域应用较为广泛。

3、淀粉酶主要存在于动物、植物及微生物中，目前大多数以微生物来源淀粉酶应用最为广泛,通过筛选烟叶中的淀粉酶高产菌株并进行发酵条件优化，提高菌株酶活及烟叶淀粉降解率，对烟用微生物的工业应用及提升烟叶品质具有一定指导意义。

技术实现思路

1、本发明提供了一种路氏肠杆菌t977及其分离方法，通过分离获得的enterobacterludwigii t977，该菌株具有显著的淀粉降解能力，为烟叶淀粉降解提供更多高效菌株选择。

2、本发明还提供一种路氏肠杆菌t977针对田间烟叶淀粉降解的处理方法，田间喷施处理能够使淀粉的含量下降，总糖含量增加，为高淀粉含量烟叶的提质提供了一种新的有效技术手段。本发明提供的路氏肠杆菌t977尤其用于降解云烟97烟叶淀粉，效果显著。

3、本发明具体技术方案如下：

4、一种路氏肠杆菌t977，保藏编号：cctcc m 20232627，所述路氏肠杆菌t977已经于2023年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，建议的分类命名为enterobacter ludwigii(pantoea agglomerans)。

5、路氏肠杆菌，拉丁文学名：enterobacter ludwigii。

6、所述路氏肠杆菌t977菌株的16s rdna的核苷酸序列如seq id no：1所示。

7、所述路氏肠杆菌t977的菌落呈现白色，半透明、边缘整齐、中央与边缘颜色一致，湿润，凸起，易挑取菌落为乳白色，在显微镜下该菌株呈杆状，有芽孢，适宜生长温度为32℃～37℃，适宜ph范围为ph 5～7。

8、本发明提供的一种路氏肠杆菌t977的分离方法，具体为：取云烟97叶片烟叶均匀部位，切取5×5mm的组织块，将5g剪碎烟叶装入250ml三角瓶中，加入已灭菌的100ml0.1％淀粉水溶液，扩大培养24h，取100μl菌液涂布接种于淀粉固体培养基上，放置于37℃恒温培养箱中培养24h后进行观察，在长出的菌落上滴加卢戈氏碘液，挑取透明圈直径较大的菌落，采用划线法进行分离纯化；分离纯化后的菌株再次使用卢戈氏碘液确定其产淀粉酶活性，并测量菌株的淀粉透明圈直径和菌落直径，计算其比值；纯化后的菌株采用15％无菌甘油管及平板保藏。纯化后的菌落挑取接种于lb液体培养基中，于30℃进行振荡培养扩繁。获得的菌液与25％的甘油溶液混合，保持细菌菌液终浓度为18％～25％，并置于-80℃冰箱保存。

9、路氏肠杆菌enterobacter ludwigii t977通过16s rdna鉴定引物pcr扩增测序，进行ncbi的blast比对，表明其与enterobacter ludwigii strain en-119遗传距离最近，仅为-0.00024，通过用邻接法构建的进化树显示的结果，结合16s rdna序列及细菌显微形态，最终鉴定为路氏肠杆菌enterobacter ludwigii t977。

10、本发明提供的一种路氏肠杆菌t977在降解烟叶淀粉的应用，用于降解烟叶淀粉；尤其用于降解云烟97淀粉。

11、用于降解烟叶淀粉的方法为：将路氏肠杆菌t977进行发酵培养，取发酵后的菌液对田间旺长期烟叶进行喷施。

12、所述发酵培养使用的培养基为：牛肉膏1.0g，乙酸铵0.25g，蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，淀粉2.5g，自来水定容至1000ml，ph调至6。

13、所述发酵培养，路氏肠杆菌t977在培养基中添加质量百分比为0.5％-1％，发酵条件为30℃-37℃，36-48h。

14、所述喷施，以菌液1×104cfu/ml～3×104cfu/ml浓度按照50l～60l量/亩进行喷施。

15、所述喷施，在采收前一个月开始喷，每隔10天喷施一次，烘烤采收前共喷施3次。

16、优选的，将路氏肠杆菌t977制成菌剂，用于降解烟叶淀粉，具体方法为：

17、1)活化菌种：将菌株路氏肠杆菌t977至于na平板上，30℃培养18h-24h；

18、2)制备种子液：刮取步骤1)中菌体，接种于t977液体培养基，牛肉膏1.0g，乙酸铵0.25g，蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，淀粉2.5g，自来水定容至1000ml，ph调至6，30℃，150rpm条件下摇床过夜培养；

19、3)扩大培养：将步骤2)中种子液按1％比例接种至发酵培养使用的培养基，30℃，150rpm条件下摇床过夜培养至od600＝2.0；

20、4)制备菌剂：将步骤3)中发酵液采用无菌水进行稀释至1×104cfu/ml，搅拌混匀，即为应用于降解烟叶淀粉的菌剂。

21、本发明通过淀粉平板法初筛能够降解淀粉酶的路氏肠杆菌enterobacterludwigii t977，其淀粉酶活高达23.5u/ml。本发明研究表示，采用路氏肠杆菌enterobacter ludwigii t977的发酵液，以1×104cfu/ml～3×104cfu/ml浓度按照50l～60l量/亩对田间生长云烟97旺长期烟叶进行喷施3次喷施后，其烟叶中的淀粉含量降低。

技术特征：

1.一种路氏肠杆菌t977，其特征在于，所述路氏肠杆菌t977的保藏编号：cctcc m20232627。

2.根据权利要求1所述的路氏肠杆菌t977，其特征在于，所述路氏肠杆菌t977菌株的16s rdna的核苷酸序列如seq id no：1所示。

3.一种权利要求1或2所述的路氏肠杆菌t977的分离方法，其特征在于，所述分离方法为：

4.一种权利要求1或2所述路氏肠杆菌t977在降解烟叶淀粉的应用，其特征在于，用于降解烟叶淀粉。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，路氏肠杆菌t977用于降解云烟97淀粉。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，用于降解烟叶淀粉的方法为：将路氏肠杆菌t977进行发酵培养，取发酵后的菌液对田间旺长期烟叶进行喷施。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养使用的培养基为：牛肉膏1.0g，乙酸铵0.25g，蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，淀粉2.5g，自来水定容至1000ml，ph调至6。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养，路氏肠杆菌t977在培养基中添加质量百分比为0.5％-1％，发酵条件为30℃-37℃，36-48h。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述喷施，以菌液1×104cfu/ml～3×104cfu/ml浓度按照50l～60l量/亩进行喷施。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述喷施，在采收前一个月开始喷，每隔10天喷施一次，烘烤采收前共喷施3次。

技术总结本发明提供了一种路氏肠杆菌T977及其分离方法和在降解烟叶淀粉的应用，通过分离获得的Enterobacter ludwigii T977，能够降解烟叶淀粉，保藏编号：CCTCC M 20232627，所述路氏肠杆菌T977已经于2023年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，建议的分类命名为Enterobacter ludwigii(Pantoea agglomerans)。该菌株具有显著的淀粉降解能力，对云烟97旺长期烟叶进行喷施后，其鲜烟叶和烤后烟叶中部叶和上部叶中的淀粉含量降低，操作简便，效果显著，为降解烟叶淀粉降解提供更多高效选择。技术研发人员：高琴,董祥洲,程廷明,赵利梅,朱启法受保护的技术使用者：安徽皖南烟叶有限责任公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10