一种检测谷物中赭曲霉毒素A的开关型电化学发光适配体传感器制备方法

本发明涉及一种开关型电化学发光适配体传感器和这种传感器的制备方法以及使用方法，属于电化学发光适配体传感器。

背景技术：

1、真菌毒素污染是一个全球性问题，对食品和饲料安全构成重大威胁。在各种类型的真菌毒素中，赭曲霉毒素a（ota）是一种具有代表性的毒素，储量丰富，污染食物，并与严重的健康问题有关，如肾毒性、肝毒性、神经毒性、致畸性、致癌性和人体免疫毒性。欧盟已经确定了谷物（5 g/kg）、葡萄酒（2 g/kg）和咖啡制品（5 mg/kg）中的最大浓度。开发一种快速灵敏的检测技术以实现准确的ota检测至关重要。

2、赭曲霉毒素a的检测方法：目前赭曲霉毒素a的检测方法主要有气相色谱法、酶联免疫吸附试验、色谱法、毛细管电泳、比色法、荧光分析和表面增强拉曼光谱等。虽然这些方法提供了定量和定性结果，但它们耗时，需要昂贵的设备，涉及复杂的样品制备步骤，并且需要训练有素的人员。因此，一种可靠、灵敏的赭曲霉毒素a检测方法对于保证食品安全及人类生命安全至关重要。

3、电化学发光（ecl）技术作为在化学发光的基础上发展起来的一种强有力的分析方法，无需引入外部光源，在光电倍增管等光学仪器的辅助下采集发光强度图谱，并建立其与待测物关系从而实现微量分析，结合了电化学技术的高可控性和化学发光技术的高灵敏性，具有可控性强、背景信号较低、选择性好、响应时间短、操作简单等优势；核酸适配体是由指数富集配体系统进化（selex）筛选得出一种新型识别元件，具有与抗体相当的高亲和力、高灵敏度，其合成简单快速、成本低、选择性好、稳定性高且易于修饰标记，能够与靶标物质快速、高亲和力和高特异性结合，将适配体末端交联到固相载体作为捕获分子，去捕获待测标本中的靶标物质，所以适配体检测真菌毒素也随之发展起来。

4、发光体的选择在构建ecl适配体传感器中至关重要。在各种ecl发光体中，基于联吡啶钌（ru(bpy)32+）的ecl系统具有较高的发光效率和化学稳定性，使其成为复杂环境中传感应用的理想选择。由于量子点（qds）具有高发光品质、强生物相容性、良好的稳定性和低毒性，随着纳米技术的快速发展，量子点已经成为ecl研究领域的热门话题。基于开关型的结构设计也提高了生物传感器的稳定性和敏感性，因为其在不同状态之间显著的信号差异。在开关系统中，获得高ecl强度的“开”信号和低ecl强度的“关”信号是实现高灵敏度的关键，这也是开关系统结构设计中的两个关键点。

5、 发明的目的在于提供一种能克服上述问题以及制备简单、操作灵活、灵敏度高、准确性高、选择性及稳定性好的开关型电化学发光适配体传感器，将硫化镉量子点（cdsqds）与适配体通过共价键结合，并通过适配体与其互补链的有效连接成功地与传感器相连。通过硫化镉量子点与联吡啶钌的有效连接，缩短电化学反应过程中的电子转移距离，从而提高适配体传感器

6、的ecl强度。构建的传感器无需酶的催化作用，直接通过适配体与靶标物质特异性结合，可对谷物中赭曲霉毒素a特定检测的电化学发光适配体传感器的制备方法。

技术实现思路

1、技术方案为：一种检测赭曲霉毒素a的适配体传感器的制备方法，其特征在于：适配体传感器的敏感界面为碳化钛（ti3c2tx）mxene材料，通过共反应键使得修饰有硫化镉量子点的适配体能够牢固地固定在电极表面，以实现cds qds与ru(bpy)32+的有效连接。当引入ota后，使cds-apt从传感器接口释放，从而降低适配体传感器的ecl强度，使传感器处于“关”状态。通过传感器“开”状态的高ecl强度，与“关”状态的低ecl强度形成鲜明对比，可以显著增强传感器的灵敏度和稳定性。

2、 所述的一种检测赭曲霉毒素a的适配体传感器的制备方法，其特征在于：玻碳电极（d=3mm）的清洗，适配体传感器敏感界面（ti3c2tx mxene）的表征，cds qds的合成，适配体传感器工作曲线的建立，适配器传感器性能的检测，传感器对实际样品的检测。

3、 所述的一种检测测赭曲霉毒素a的适配体传感器的制备方法，其特征在于：实验条件的优化，主要包括测试底液的ph、适配体浓度、适配体与互补链的杂交时间以及适配体与靶标物质的孵育时间；所制备的适配体传感器的工作曲线为：y = 11123.73 ‒4035.98lgx （ r2=0.994）；适配体传感器性能检测包括特异选择性、重现性、稳定性以及适配体传感器对谷物样品回收率的测定。

4、目标物质电化学发光检测：采用电化学发光检测法利用三电极体系在最佳实验条件下检测谷物样品，根据检测结果中电化学发光强度值进行分析即可获知电化学发光强度峰值大小与该赭曲霉毒素a的浓度成反比，据此可获得赭曲霉毒素a的浓度信息。

5、 本发明的制备原理为：本发明采用碳化钛（ti3c2tx）mxene作为基底纳米材料，将cds qds作为ecl试剂ru(bpy)32+的共反应物应用到ecl实验中，通过cds qds与ru(bpy)32+的有效连接缩短了电子转移距离，从而提高了ecl强度，实现第一次“开”状态。当引入ota后，使得cds qds与ru(bpy)32+失去有效连接，使传感器处于“关”状态。通过传感器“开”状态的高ecl强度，与“关”状态的低ecl强度形成鲜明对比，增强了传感器的灵敏度和稳定性。通过经上述步骤制备的适配体传感器，简单灵敏，稳定性和特异性较好，重现性好，而且回收率符合要求。

6、 为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测赭曲霉毒素a的适配体传感器的制备方法，其特征在于：（1）适配体传感器制备前裸玻碳电极的清洗、活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在100 mv以下，氧化峰和还原峰对称，则所述的玻碳电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合。（2）清洗好的玻碳电极表面滴涂分散均匀的ti3c2tx mxene，继而修饰联呲啶钌-壳聚糖（ru(bpy)32+-cs）溶液，通过壳聚糖中的羟基和适配体互补链中的氨基进行羟氨基化，使得cdna能够牢固地固定在电极表面。滴涂bsa溶液以封闭非特异性位点，将修饰有适配体的cds溶液（cds-apt）滴加在电极上，最后加入靶标物质。适配体传感器制备结束后，放入4℃冰箱里保存备用。

7、为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测赭曲霉毒素a的适配体传感器的制备方法，其特征在于：（1）将上述制备好的适配体传感器在工作底液中用电化学发光方法检测，得到峰值和靶标物质的关系；（2）配置一系列的ota浓度标准液，进行电化学发光方法测定，进一步得到上述制备的适配体传感器的工作曲线、检测范围和检测限；（3）配置一系列常见的霉菌毒素溶液，以检测所制备的适配体传感器的选择性；（4）使用电化学发光法多次验证上述适配体传感器的稳定性和重复性；（5）对实际谷物样品进行分析得出适配体传感器的回收率。

8、 本发明提出的开关型电化学发光适配体传感器在赭曲霉毒素a的检测中表现出优异的分析性能，具有较高的灵敏度、较低的检出限和较宽的检测范围，这得益于“开”阶段与“关”阶段之间较大的信号差异。“开”状态是由ru(bpy)32+和cds qds之间的电化学发光反应提供，产生了较高的背景信号。“关”状态是由通过ota的修饰使得cds-apt从电极表面释放，从而导致发光信号的降低，达到“关”状态。高强度的“开”信号和低强度的“关”信号保证了开关型电化学发光系统的灵敏度。此外，所开发的电化学发光适配体传感器成功地用于检测小麦和燕麦样品中的ota，证明了其在实际应用中的实用性。

9、 所述适配体传感器的制备工艺如下：将预处理后的gce依次滴入5 µl ti3c2txmxene溶液，在室温下自然干燥后，滴加5 µl ru(bpy)32+-cs混合溶液。然后在电极表面滴入5 µl cdna溶液，在37℃下孵育，壳聚糖中的羟基和适配体互补链中的氨基进行羟氨基化，使得cdna能够牢固地固定在电极表面。接下来，为了关闭非特异性结合位点，在电极表面涂上浓度为0.5%的bsa溶液。然后，将修饰有适配体的cds溶液（cds-apt）滴加在电极上，孵育45 min，使其与互补链结合，放入4℃的环境下避光保存，以待后续检测实际样品中的赭曲霉毒素a。所用氨基修饰的适配体互补链序列为：5′-nh2-tgtccgatgctccctttacgccacccacacccgatc-3′；所用二茂铁修饰的适配体序列为：5′- nh2-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3′。