融合蛋白、工程化免疫细胞及其制备方法和应用与流程

本申请涉及生物医学，特别涉及一种融合蛋白、工程化免疫细胞及其制备方法和应用。

背景技术：

1、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，tils)是由cd8+t细胞、cd4+t细胞、b细胞、nk细胞、γδt细胞以及固有淋巴细胞(innate lymphocytes,ilcs)等组成的异质性细胞群体。经体外扩增培养后，cd3+t细胞成为最主要细胞群体(所占比例通常大于95％)。cd3+t细胞表面表达tcr受体，在介导癌变细胞的免疫杀伤中起关键作用。由于不同的tcr受体识别主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，mhc)分子所呈递的不同抗原肽，从而赋予t细胞抗原特异性。因此，一旦针对某抗原特异性t细胞受到特定抗原刺激，这些细胞可通过释放细胞毒素和受体介导机制等方式，以促进靶细胞的程序性死亡。

2、与car-t(chimeric antigen receptor t-cell)/tcr-t细胞治疗产品不同的是，通常tils是通过识别肿瘤细胞所呈递出来的肿瘤相关抗原，如新抗原(neoantigen)等，从而发挥抗肿瘤作用。因此，til疗法可通过识别和靶向多种肿瘤相关抗原以达到抗肿瘤治疗目的。

3、然而，由于受肿瘤微环境中存在多种免疫抑制相关因素的调控作用，til高表达免疫检查点相关分子，如pd-1、ctla4、tim3、lag3、tigit等。同时，由于持续性地受到肿瘤相关抗原的刺激作用，til呈现出高度耗竭状态，如高表达tox、id3等耗竭相关转录因子。即使将til分离，在体外进行重新激活后，til的杀伤功能仍受到限制。因此，如何增强til的持续地抗肿瘤功能是亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、基于此，本申请一个或者多个实施例提供一种融合蛋白、工程化免疫细胞及其制备方法和应用。

2、本申请的一个或者多个实施例提供一种融合蛋白；

3、自胞外结构域一端至胞内结构域一端，所述融合蛋白包括il-12p40亚基和膜蛋白，所述膜蛋白用于将所述il-12p40亚基锚定在细胞膜上。

4、在本申请的一些实施方式中，所述膜蛋白包括i型膜蛋白、ii型膜蛋白、多次跨膜蛋白和糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,gpi)锚定蛋白中的一种或者多种。

5、在本申请的一些实施方式中，所述膜蛋白具有以下至少一种蛋白的跨膜结构域或者所述跨膜结构域的部分区域：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd48、cd55、cd64、cd80、cd86、cd90、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、icos、gitr、cd40、baffr、hvem、slamf7、nkp80、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、tgfβrii、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、itgb7、tnfr2、dnam1、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、ly9、psgl1、cd100、slamf6、slam、blame、selplg、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、和nkg2c。

6、在本申请的一些实施方式中，所述il-12p40亚基和所述膜蛋白直接或间接连接。

7、在本申请的一些实施方式中，所述il-12p40亚基和所述膜蛋白通过柔性linker和/或铰链区中的一个或者多个相连接。

8、在本申请的一些实施方式中，所述铰链区选自以下至少一种蛋白的铰链区：igg1、igg4、igg4m、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos和cd154。

9、在本申请的一些实施方式中，所述融合蛋白从胞外结构域到胞内结构域依次包括所述il-12p40亚基、所述柔性linker、所述铰链区和所述膜蛋白。

10、在本申请的一些实施方式中，所述融合蛋白的n端连接有信号肽或者内在信号锚定序列片段。

11、本申请的一个或者多个实施例提供一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞过表达所述融合蛋白。

12、在本申请的一些实施方式中，所述工程化免疫细胞包括car-t、tcr-t、til和car-nk中的一种或者多种。

13、本申请的一个或者多个实施例提供一种所述的工程化免疫细胞的制备方法，其包括如下步骤：

14、提供一种待改造免疫细胞，对所述待改造免疫细胞进行改造使表达所述的融合蛋白，从而构建工程化免疫细胞。

15、本申请的一个或者多个实施例提供一种核酸分子，其编码上述的融合蛋白。

16、本申请的一个或者多个实施例提供一种载体，其包括所述的核酸分子。

17、在本申请的一些实施方式中，所述载体包括慢病毒、γ逆转录病毒载体和脂质纳米颗粒中的一种或者多种。

18、本申请的一个或者多个实施例提供一种所述的工程化免疫细胞、所述的核酸分子或者所述的载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

19、在本申请的一些实施方式中，所述抗肿瘤药物预防或/和治疗如下肿瘤：肝癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等实体肿瘤。

20、本申请的一个或者多个实施例提供一种药物，其包括所述的工程化免疫细胞，以及药学上可以接受的载体。

21、相对于传统技术，本申请的有益效果包括：

22、本申请通过将il-12的p40亚基与具有锚定作用的膜蛋白相连，使得p40亚基通过膜蛋白锚定在免疫细胞(例如为til)的细胞膜表面，意外地达到增强免疫细胞的增殖能力和抗肿瘤杀伤效果。同时，也提升了il-12用于抗肿瘤治疗的安全性。

技术特征：

1.融合蛋白；

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述膜蛋白包括i型膜蛋白、ii型膜蛋白、多次跨膜蛋白和糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白中的一种或者多种。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述膜蛋白具有以下至少一种蛋白的跨膜结构域或者所述跨膜结构域的部分区域：t细胞受体的α链、t细胞受体的β链、t细胞受体的ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd48、cd55、cd64、cd80、cd86、cd90、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、icos、gitr、cd40、baffr、hvem、slamf7、nkp80、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、tgfβrii、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、itgb7、tnfr2、dnam1、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、ly9、psgl1、cd100、slamf6、slam、blame、selplg、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、和nkg2c。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中，所述il-12p40亚基和所述膜蛋白间接连接。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述il-12p40亚基和所述膜蛋白通过柔性linker和/或铰链区中的一个或者多个相连接。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述铰链区选自以下至少一种蛋白的铰链区：igg1、igg4、igg4m、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos和cd154。

7.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白从胞外结构域到胞内结构域依次包括所述il-12p40亚基、所述柔性linker、所述铰链区和所述膜蛋白。

8.根据权利要求1至3和5至7中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的n端连接有信号肽或者内在信号锚定序列片段。

9.工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞过表达权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的工程化免疫细胞，其中，所述工程化免疫细胞包括car-t、tcr-t、til和car-nk中的一种或者多种。

11.权利要求9至10中任一项所述的工程化免疫细胞的制备方法，其包括如下步骤：

12.核酸分子，其编码权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白。

13.一种载体，其包括权利要求12所述的核酸分子。

14.根据权利要求13所述的载体，其中，所述载体包括慢病毒、γ逆转录病毒载体和脂质纳米颗粒中的一种或者多种。

15.权利要求9至10中任一项所述的工程化免疫细胞、权利要求12所述的核酸分子或者权利要求13至14中任一项所述的载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

16.根据权利要求15中所述的用途，其中，所述抗肿瘤药物预防或/和治疗如下肿瘤：肝癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤。

17.一种药物，其包括权利要求9至10中任一项所述的工程化免疫细胞，以及药学上可以接受的载体。

技术总结本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种融合蛋白、工程化免疫细胞及其制备方法和应用。自胞外结构域至胞内结构域，所述融合蛋白包括IL‑12p40亚基和膜蛋白，所述膜蛋白用于将所述IL‑12p40亚基锚定在细胞膜上。本申请通过将IL‑12的p40亚基与具有锚定作用的膜蛋白相连，使得p40亚基通过膜蛋白锚定在免疫细胞(例如为TIL)的细胞膜表面，从而达到增强TIL的抗肿瘤杀伤效果，同时，也提升了IL‑12用于抗肿瘤治疗的安全性。技术研发人员：刘明宇,卢永,刘秋燕,张曦,韩德平受保护的技术使用者：广州百吉生物制药有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10