用于检测εPA44多肽纯度的多肽及其制备方法和应用与流程

本发明属于多肽药物质量控制，具体涉及一种用于检测εpa44多肽纯度的多肽及其制备方法和应用。

背景技术：

1、εpa44多肽是一种水不溶性多肽，是针对hbeag阳性慢性乙型肝炎患者的治疗性疫苗，在临床试验中，疗效显著。但是εpa44多肽的纯度会影响疗效，因此在εpa44多肽的生产中，需要对εpa44多肽的质量进行控制。

2、εpa44多肽的合成过程会产生很多已知或未知的杂质，这些杂质会影响εpa44多肽的纯度，需要对其进行调查，并限制其在最终产品中的含量，从而进行εpa44多肽的质量控制。在各大药典中，单一杂质的含量要求控制在1％以下，并且对杂质进行结构鉴定是药品注册的基本要求。εpa44多肽的部分杂质难以分离和确认，因此无法得到标准品对杂质进行质控，需要进一步完善εpa44多肽的杂质谱，提高εpa44多肽的质量控制水平。

技术实现思路

1、本申请通过分析εpa44多肽发现了εpa44多肽中的尚未被发现的两种多肽，并对其进行了分离，得到了两种多肽的结构；两种新多肽的发现有利于提高εpa44多肽质量控制水平。

2、因此，本发明一方面提供一种用于检测εpa44多肽纯度的多肽，其氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。

3、本发明另一方面提供一种上述的用于检测εpa44多肽纯度的多肽的制备方法，其包括：使用fmoc固相合成法进行合成。

4、本发明再一方面提供一种上述的用于检测εpa44多肽纯度的多肽在εpa44多肽质量控制中的应用。

5、本发明再一方面提供一种εpa44多肽纯度的检测方法，其检测方法包括：以上述的多肽为标准品，使用液相色谱法进行线性梯度洗脱，具体按照以下步骤进行检测：

6、标准溶液配制及标准曲线绘制：以二甲基亚砜(dmso)为溶剂，溶解标准品，浓度为0.1μg/ml-100μg/ml，上样检测并绘制标准曲线；

7、样品溶液制备：以二甲基亚砜(dmso)为溶剂，溶解εpa44粗肽，按照εpa44多肽纯化方法纯化，根据色谱峰分段收集馏分，以收集的馏分为样品溶液，上样检测；

8、根据标准品和其他杂质的峰面积，利用标准曲线和校正因子，计算εpa44多肽在样品溶液中的含量，即得εpa44多肽纯度。

9、本发明有益效果至少包括：

10、(1)本发明首次公开了εpa44多肽未知的如seq id no.1所示和seq id no.2所示的多肽杂质，扩充了εpa44多肽的杂质谱，对εpa44多肽质量研究具有重要意义。

11、(2)本发明首次公开了εpa44多肽未知的如seq id no.1所示和seq id no.2所示的多肽杂质的制备方法，制备的杂质样品纯度高，反应条件温和，适用于杂质制备。

技术特征：

1.用于检测εpa44多肽纯度的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1或seqid no.2所示。

2.权利要求1所述的用于检测εpa44多肽纯度的多肽的制备方法，其特征在于，包括：使用fmoc固相合成法进行合成。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1所示的用于检测εpa44多肽纯度的多肽的制备方法包括：(1)将fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-tyr(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-tyr(otbu)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、boc-lys(fmoc)-oh和棕榈酸依次偶联至树脂上得肽树脂；其中，fmoc-arg(pbf)-oh和棕榈酸采用双偶联的方法；(2)乙酸酐和吡啶的混合溶剂用dmf稀释后加入到固相反应柱，室温反应；反应结束后dmf和甲醇洗涤，真空干燥肽树脂至流沙状，得到干燥肽树脂；(3)干燥肽树脂与裂解液混合，室温搅拌，过滤树脂，收集滤液；用tfa洗涤树脂，合并滤液；将滤液缓慢加入冰乙醚中沉淀；离心，冰乙醚洗涤3次，氮气吹干得到粗肽；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，制备方法还包括：将粗肽加入二甲基亚砜进行溶解；将色谱柱用洗涤液冲洗干净，用洗涤液平衡系统后，进行hplc纯化，采用280nm、254nm和215nm波长监测，根据色谱峰分段收集馏分，并将收集的馏分用分析液相色谱仪进行检测，纯度大于等于99.5％且单杂小于0.5％馏分即为合格馏分，其余为不合格馏分，作废液处理；合格馏分经超滤浓缩，质量分数48％-52％乙醇稀释处理，将磷酸浓度降至80μm以下；真空干燥除去乙醇后，冻干得到氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示的多肽；其中，洗涤液为质量分数为28％-32％乙醇溶液，乙醇溶液还含有8mm-12mm磷酸的。

5.权利要求1所述的用于检测εpa44多肽纯度的多肽在εpa44多肽质量控制中的应用。

6.εpa44多肽纯度的检测方法，其特征在于，其检测方法包括：以权利要求1所述的多肽为标准品，使用液相色谱法进行线性梯度洗脱，具体按照以下步骤进行检测：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，液相色谱法中的流动相a为含0.1％tfa的h2o，流动相b为含0.1％tfa的乙腈，线性梯度洗脱程序如下：

8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，液相色谱法中的条件还包括以下条件中的一种或多种：(1)色谱柱：c18分析柱，粒度5μm，孔径柱直径3.9mm，柱长150mm；(2)保护柱：粒度5μm，孔径柱直径3.9mm，柱长20mm；(3)流速：1ml/min；(4)检测波长：214mm；(5)注温：25℃。

技术总结本发明属于多肽药物质量控制技术领域，具体涉及一种用于检测εPA44多肽纯度的多肽及其制备方法和应用。用于检测εPA44多肽纯度的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。上述的εPA44多肽的公开扩充了εPA44多肽的杂质谱，对εPA44多肽质量研究具有重要意义。技术研发人员：金怡,贾正才受保护的技术使用者：诺合泰生物科技（重庆）有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/10