抗番茄褐色皱果病毒的突变体及其应用

本发明涉及病毒病生物防治，具体涉及一种抗番茄褐色皱果病毒的突变体及其应用。

背景技术：

1、番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus，tobrfv)属于烟草花叶病毒属(tobamovirus)，主要危害番茄和辣椒，引起叶片的疱斑、窄叶和花叶症状，引起番茄果实的褐色皱缩、坏死症状，引起叶柄、花梗、花萼的坏死，同时病株常表现矮化(panno等，2019；yan等，2020b)。tobrfv非常稳定且极易传播和侵染，它可在水中、物体表面以及没有活体植物的情况下存活很长时间并保有侵染力，有研究表明番茄温室内只要有少数受tobrfv侵染的番茄植株存在就足以在短时间内毁灭整茬番茄(panno等，2020a)。目前对tobrfv没有有效的防治方法，一旦田间出现病株病果，只能铲除焚毁。

2、番茄tm-22基因属于nbs-lrr家族，是防治烟草花叶病毒属病毒的重要抗性基因，在商品化的番茄品种中普遍存在，然而tobrfv完全打破了番茄上的tm-22抗性，即目前商品化的含有tm-22基因的番茄品种对tobrfv表现易感。

3、因此，为提高植物对tobrfv的抗性，需要进一步对抗病基因tm-22进行改造，获得能够抗tobrfv的突变体。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种抗番茄褐色皱果病毒的突变体及其应用。本发明通过对抗病基因tm-22进行人工进化，获得了两个新的抗番茄褐色皱果病毒的突变体，为tobrfv的防治提供了新的方向。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种抗番茄褐色皱果病毒的突变体，所述突变体为tm-22-mut3-1或tm-22-mut4；

4、所述tm-22-mut3-1的氨基酸序列如seq id no.2所示；

5、所述tm-22-mut4的氨基酸序列如seq id no.4所示。

6、上述突变体tm-22-mut3-1，是将番茄tm-22基因编码蛋白的第767位的酪氨酸(y)突变为色氨酸(w)。上述突变体tm-22-mut4，是将番茄tm-22基因编码蛋白的第354位氨基酸由异亮氨酸(i)突变为甲硫氨酸(m)，第767位的酪氨酸(y)突变为色氨酸(w)。

7、本发明的第二方面，提供上述抗番茄褐色皱果病毒的突变体的编码基因。

8、作为优选，所述编码基因为如下i)-iv)任一所示的核酸分子：

9、i)核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；

10、ii)除i)以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子；

11、iii)核苷酸序列是seq id no.3所示的核酸分子；

12、iv)除iii)以外的编码seq id no.4所示氨基酸序列的核酸分子。

13、上述编码基因，其中，i)和ii)所示的核酸分子是突变体tm-22-mut3-1的编码基因；iii)和iv)所示的核酸分子是突变体tm-22-mut4的编码基因。

14、本发明的第三方面，提供包含上述编码基因的重组表达载体或工程菌。

15、本发明的第四方面，提供上述抗番茄褐色皱果病毒的突变体在如下(1)或(2)中的应用：

16、(1)防治番茄褐色皱果病毒；

17、(2)制备防治番茄褐色皱果病毒的产品。

18、本发明的第五方面，提供上述抗番茄褐色皱果病毒的突变体的编码基因或者包含上述编码基因的重组表达载体或工程菌在如下(1)或(2)中的应用：

19、(1)防治番茄褐色皱果病毒；

20、(2)培育抗番茄褐色皱果病毒的植物品种。

21、优选的，所述植物品种为番茄或烟草。

22、本发明的第六方面，提供一种提高植物对tobrfv抗性的方法，包括以下步骤：

23、将植物tm-22基因的编码区序列的第2300位核苷酸由a突变为g、第2301位核苷酸由c突变为g；

24、或者，植物tm-22基因的编码区序列的第1062位核苷酸由a突变为g、第2300位核苷酸由a突变为g、第2301位核苷酸由c突变为g；

25、或者，向植物中外源转入抗番茄褐色皱果病毒的突变体的编码基因。

26、本发明的有益效果：

27、(1)本发明通过随机突变获得抗tobrfv弱的突变体，进一步通过定点饱和突变的方法的tm-22基因编码蛋白的第767位酪氨酸突变为其他18种氨基酸，获得18个tm-22突变体质粒，结果发现，第767位酪氨酸的不同突变方向会影响对tobrfv抗性，只有将第767位酪氨酸突变为色氨酸介导对tobrfv的抗性最强，同时保留了对tmv、tomv和tommv的抗性。

28、(2)结合前期研究，本发明将tm-22的lrr结构域和nb-arc结构域的两个位点进行组合突变，获得突变体tm-22-mut4，结果发现tm-22-mut4能够显著降低tobrfv衣壳蛋白(cp)的积累，与前期研究筛选得到的突变体pfgctm-22-mut2以及新获得的突变体pfgctm-22-mut3-1相比，其对于tobrfv的抗性有进一步的提高。

技术特征：

1.一种抗番茄褐色皱果病毒的突变体，其特征在于，所述突变体为tm-22-mut3-1或tm-22-mut4；

2.权利要求1所述的突变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因为如下i)-iv)任一所示的核酸分子：

4.包含权利要求3所述编码基因的重组表达载体或工程菌。

5.权利要求1所述的突变体在如下(1)或(2)中的应用：

6.权利要求2或3所述的编码基因或者权利要求4所述的重组表达载体或工程菌在如下(1)或(2)中的应用：

7.一种提高植物对tobrfv抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结本发明公开了一种抗番茄褐色皱果病毒的突变体及其应用，属于病毒病生物防治技术领域。本发明通过随机突变发现Tm‑2<supgt;2</supgt;的LRR结构域的第767位酪氨酸突变为苯丙氨酸对ToBRFV具有微弱抗性，进一步通过定点饱和突变的方法将Tm‑2<supgt;2</supgt;基因编码蛋白的第767位酪氨酸突变为其他18种氨基酸，获得18个Tm‑2<supgt;2</supgt;突变体质粒，结果发现，第767位酪氨酸突变为色氨酸产生的突变体Tm‑2<supgt;2</supgt;‑Mut3‑1对ToBRFV的抗性最强，同时保留了对TMV、ToMV和ToMMV的抗性。将Tm‑2<supgt;2</supgt;‑Mut3‑1的LRR结构域第767位酪氨酸突变为苯丙氨酸和前期研究得到的突变体Tm‑2<supgt;2</supgt;‑Mut2的NB‑ARC结构域第354位异亮氨酸突变为甲硫氨酸进行组合突变，获得突变体Tm‑2<supgt;2</supgt;‑Mut4，结果发现Tm‑2<supgt;2</supgt;‑Mut4能够显著降低ToBRFV衣壳蛋白的积累，与突变体pFGCTm‑2<supgt;2</supgt;‑Mut2以及新获得的突变体Tm‑2<supgt;2</supgt;‑Mut3‑1相比，其对于ToBRFV的抗性有显著提高。技术研发人员：田延平,李向东,闫志勇,张丽萌,马华玉,牟修岐,郇晓雪,江军,耿超受保护的技术使用者：山东农业大学技术研发日：技术公布日：2024/10/17