一种双层胶原蛋白海绵及其制备方法与应用与流程

本发明属于医疗外科，具体涉及一种基于改进的干热交联技术制备的胶原蛋白海绵及其应用。

背景技术：

1、外科及创伤手术中广泛出血及渗血是术中经常遇到的难题，尤其是多血管的实质性脏器，如肝脏外伤的出血，外伤时常伴有大量失血导致的凝血功能障碍，因此，及时有效的止血是降低术后死亡风险及提高术后康复的关键。

2、目前，国内外研究根据材质一般可将止血材料分为三大类：无机类止血材料、合成类止血材料与生物衍生止血材料。无机类止血材料主要包括沸石(zeolite)、高岭土(kaolin)、蒙脱土(montmorillonite)等，其主要通过分子筛作用吸附血液中大量的水分，进而加快血凝块的形成。无机类止血材料的代表是沸石止血材料quikclot，主要用在危及生命的伤害中止血，但其不可降解性和放热性的特征限制了其临床应用。合成类止血材料多为医用黏合剂，主要包括氰基丙烯酸酯类组织胶、聚乙二醇类凝胶等，这类止血材料不具有任何内源性止血功能，主要通过在伤口部位发生交联反应或快速聚合，达到迅速黏合与封闭创伤组织的目的。这种材料虽然对创面形成临时性保护和止血，其缺点也是显而易见的：1、对创面无促愈合作用；2、清创处理不彻底极易引起创面脓性感染，给患者带来新的痛苦并使病情绵延。生物衍生止血材料又可分为蛋白类止血材料和多糖类止血材料两大类，蛋白类止血材料主要来源包括胶原蛋白、明胶、纤维蛋白原等。多糖类止血材料主要来源包括纤维素、淀粉、海藻酸、壳聚糖以及其他多糖类物质。生物衍生止血材料由于其无毒性、良好的生物相容性、生物可降解性以及促凝血活性越来越受到专家学者的重视，其应用前景非常广阔。

3、动物源胶原已经广泛应用于医疗器械领域，如止血及组织修复等方面均有较为深入的研究，解决了很多临床问题，造福众多患者。而基因工程法获得的重组仿生型胶原蛋白，近年来也逐渐被更多的科研工作者深入研究，该类胶原蛋白相比于动物源胶原具有无病毒隐患、水溶性佳、更低的免疫原性等优势，故在临床领域具有理论上更安全的应用。

4、此外，凝血开始到形成凝血酶之前为止，是由内源性和外源性两个系统组成。钙离子在凝血机制中被称为凝血因子ⅳ，是多种因子的辅因子，可以同其他凝血因子一起逐级将凝血酶原转化成凝血酶，参与到内外源性凝血途径中的多个环节。

5、发明专利zl 202010052422.9中涉及的重组胶原海绵材料采用化学试剂交联，有试剂残留等风险，且在工艺中需要进行试剂残留去除，整个工艺较繁琐、生产周期较长且成本较高，故研究一种更加安全有效，同时价格更为低廉的胶原蛋白海绵迫在眉睫。

6、干热交联技术已在医用材料中普遍使用，如淀粉-壳聚糖干热交联制备的可降解止血材料、类弹性蛋白-蚕丝纤维干热交联制备的多孔复合材料、胶原-壳聚糖干热交联制备的三维多孔支架等。但是其均采用普通烘箱，有氧且高温环境下物质容易氧化发生变性，导致产品品质较差，不符合我们的预期要求。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种双层胶原蛋白海绵及其制备方法与应用，由该方法制得的生物膜具备疏松层和致密层，且批内及批间稳定性好、成品率高，具有良好的机械性能、力学性能、溶胀性能、抗降解性能、生物相容性。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种双层胶原蛋白海绵的制备方法，其包括以下步骤：

3、(1)将胶原蛋白配置成胶原蛋白溶液；

4、(2)对上述胶原蛋白溶液进行冷冻干燥，得到胶原蛋白海绵；

5、(3)将上述胶原蛋白海绵于真空条件下进行干热交联与辐照交联，得到所述双层胶原蛋白海绵；

6、其中，步骤(3)中，在真空干燥箱内超导热板上进行干热交联。

7、根据本发明的具体实施方案，优选地，步骤(1)中，所述胶原蛋白为重组胶原蛋白。

8、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述重组胶原蛋白为cn106554410a所公开的重组人源胶原蛋白，该重组人源胶原蛋白包含下列家族成员中的一种或几种：

9、1)具有序列表中seq id no:1氨基酸残基序列的蛋白质；

10、2)与seq id no:1氨基酸残基序列同源性在90％以上且具有与seq id no:1相同活性的seq id no:1衍生的蛋白质；

11、3)在seq id no:1氨基酸残基序列的n-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与seq id no:1相同活性的seq id no:1衍生的蛋白质；

12、4)在seq id no:1氨基酸残基序列的c-端增加或删除15个以内氨基酸残基得到的具有与seq id no:1相同活性的seq id no:1衍生的蛋白质；

13、5)将seq id no:1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与seq id no:1相同活性的seq id no:1衍生的蛋白质。

14、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述胶原蛋白溶液中胶原蛋白的浓度为0.5-15％，更优选为1-10％，进一步优选为1-7％。

15、根据本发明的具体实施方案，优选地，步骤(1)中，所述胶原蛋白溶液的组成还包括无机钙盐，如无水氯化钙(cacl2)，可促进机体本身内源性止血过程的发生。

16、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述胶原蛋白溶液中无水氯化钙的浓度为0.05-0.2％，更优选为0.05-0.1％，进一步优选为0.08-0.1％。

17、根据本发明的具体实施方案，配置胶原蛋白溶液具体过程例如：将0.5-15g胶原蛋白及0.05-0.2g无水氯化钙(cacl2)加入纯化水至100毫升，得到含0.05％-0.2％无水氯化钙(cacl2)的浓度为0.5％-15％的胶原蛋白溶液；或不加无水氯化钙(cacl2)，将0.5-15g胶原蛋白加入纯化水至100毫升，得到浓度为0.5％-15％的胶原蛋白溶液。

18、根据本发明的具体实施方案，优选地，步骤(2)中，所述冷冻干燥的工艺包括以下步骤：

19、(1)预冻：分两个阶段进行，预冻第一阶段的工艺参数为在30-120min内，温度从室温达到0-4℃，并持续30-180min；预冻第二阶段的工艺参数为在60-180min内，温度达-60℃至-40℃，并持续120-300min；

20、(2)升华：分三个阶段进行，升华第一阶段的工艺参数为在30-120min内，温度达-30℃至-20℃，并持续120-480min，真空度为0.20-0.50bar；升华第二阶段的工艺参数为在10-60min内，温度达-20℃至-15℃，并持续120-480min，真空度为0.10-0.20bar；升华第三阶段的工艺参数为在10-60min内，温度达-15℃至-10℃，并持续120-480min，真空度为0.05-0.10bar；

21、(3)解析干燥：在60-180min内，温度达20-40℃，并持续120-480min，真空度为0.05-0.50；

22、具体参数如下：

23、

24、根据本发明的具体实施方案，优选地，步骤(3)中，所述干热交联的工艺包括以下步骤：

25、(1)将所述胶原蛋白海绵置于真空干燥箱中的超导热板中；

26、(2)真空度设置为-0.1mpa至-0.05mpa，温度为100-220℃，进行干热交联1-6h。

27、根据本发明的具体实施方案，优选地，干热交联中，所述真空度为-0.1mpa至-0.08mpa，更优选为-0.095mpa至-0.09mpa。

28、根据本发明的具体实施方案，优选地，干热交联中，所述温度为150-220℃，更优选为180-210℃。

29、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述干热交联的时间为2-5h，更优选为3-4h。

30、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述超导热板的当量导热系数为14mw/m·℃-30mw/m·℃，是纯银的3.2万倍，例如所述超导热板为cn1238721a所公开的超导传热介质制得的。

31、本发明在超导热板上及真空条件下进行材料的干热交联，本发明所采用的高温和氧含量极低或无氧的条件不仅可以加速脱水、增强分子链之间的相互作用实现非共价交联，还可通过酯化或酰胺形成分子间交联，同时没有氧分子影响，能够避免材料发黄、变脆。本发明采用基于无机热超导技术的超导热板，该元件具有高速传热、高传热能力、均温性、热阻小、可变形结构等特点，广泛适用于均温、散热、热交换领域，可替代传统的热管技术；本发明采用超导热材料制备烘箱隔板，在进行加热时，能够瞬间升温的同时保证各部位温度均一，使胶原海绵交联过程中受热一致，可使得产品本身的品质及性能有很大的提升，同时成品率显著提高(从40％-50％提高至95％以上)，本发明克服了现有技术的偏见，可实现规模化生产，保证了产品本身及大批量情况下的均一稳定性，材料可以同时灭菌和交联。

32、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述辐照交联为钴60辐照交联，辐照交联可通过射线引发聚合物线性分子通过大分子间共价键的生成和积累，转化为分子质量很大的三维网状结构的过程和结果；通过辐照交联可以在很大成程度上提升产品的交联度，从而使产品的力学性能、抗降解性能、柔韧性等显著提升。

33、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述辐照交联的交联剂量为20kgy-35kgy，更优选为25kgy-35kgy，进一步优选为30kgy-35kgy。

34、本发明还提供了一种双层胶原蛋白海绵，其由上述的制备方法制得。

35、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述双层胶原蛋白海绵的一侧为致密结构，另一侧为疏松结构。

36、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述双层胶原蛋白海绵的厚度为1-4mm。

37、本发明还提供了上述双层胶原蛋白海绵在制备医用材料中的应用。

38、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述医用材料为用于口腔颌面外科、神经外科、普外科或骨科医疗中的止血材料、修复材料或充填材料。

39、根据本发明的具体实施方案，优选地，所述医用材料为用于创伤、烧伤和手术创面的止血材料、修复材料或残腔的充填材料。

40、根据本发明的具体实施方案，上述双层胶原蛋白海绵的制备方法具体包括以下步骤：

41、(1)将胶原蛋白配置成胶原蛋白溶液，常温静置除泡；

42、(2)将上述胶原蛋白溶液加入冻干模具并进行真空冷冻干燥，得到具有三维结构的胶原海绵；

43、(3)将上述胶原蛋白海绵放入超导热电热真空干燥箱的超导热板内，设置程序，真空度为-0.1mpa至-0.05mpa，温度为100℃-220℃，交联时间为1h-6h；关上箱体门后开始抽真空，待真空度达到设定范围后超导热板瞬间加热；

44、(4)进行辐照交联，得到所述双层胶原蛋白海绵。

45、本发明所提供的胶原蛋白海绵是基于改进的干热交联技术，并采用物理双交联技术得到，其中，改进的干热交联技术是通过超导热电热真空干燥箱内超导热板上进行干热交联，所得产品具有以下有益效果：

46、(1)外观及性状更优，均一性更好，得到由疏松层和致密层组成的(即一侧为疏松结构，另一侧为致密结构)的双层胶原蛋白海绵；

47、(2)批内及批间稳定性好、成品率高、机械性能较好、质地柔软有韧性，力学性能、溶胀性能、抗降解性能显著提高；

48、(3)同时具有良好的生物相容性、无毒、无抗原反应，免疫原性低、降解可控；

49、(4)具有优良的粘附性，可有效粘附于使用部位，止血效果好，在使用过程中能够轻压置于组织创面后，能与创面紧密贴附，吸收体液，机械性封闭血管开口，且在人体活动过程中不会移位，可广泛应用于口腔颌面外科、神经外科、普外科以及骨科等医学领域，例如用于创伤、烧伤和手术创面的止血、修复及残腔的充填；

50、(5)制备工艺简单，大大节省了成本、缩短了生产周期，不但安全有效，且价格更为低廉，成品率高，适合大批量生产。