快速植物叶片检测方法与流程

本发明涉及植物检测领域，具体的说，涉及一种快速植物叶片检测方法。

背景技术：

1、随着生物育种技术的快速发及我国《农业转基因生物安全评价管理办法》、《主要农作物品种审定办法》、《农作物种子生产经营许可管理办法》、《农业植物品种命名规定》及新修订的《种子法》的施行，2022年也被视为中国转基因商用元年。转基因事件检测技术以国标法实时荧光定量pcr技术为主，检测流程包括dna提取、引物合成、试剂配置、仪器检测、数据分析等，检测流程复杂、耗时长、需要特定实验室和专业人员；快速检测以胶体金和elisa技术为主，虽然检测灵活方便，但受技术影响，只能检测蛋白表达，无法区分合法与非法转基因事件，不能作为法律依据。另外，随着植物功能基因及基因编辑的研究，越来越多功能位点将应用到植物育种中。面对多种转基因商业化事件的定性快速检测和执法取证检测以及知识产权保护的需要，开发一套技术先进、流程简易、操作简便的核酸快速检测方法，可以为我国作物分子育种推广和知识产权保护提供必备的技术手段。

2、lamp技术是在2000年由日本荣研化学株式会社纳富继宣博士发明的一种的恒温基因扩增技术，具备扩增快速、结果准确、成本低等特点。目前用于转基因检测的方法还主要为pcr方法，虽有不少文献专利报道利用lamp进行转基因检测，但核酸处理、结果观察等还是脱离不了实验室环境。段志强等(zhiqiang duan 2022)报道利用cas12a试纸条结合lamp技术可以直接检测简单处理的植物叶片，40分钟内可以完成lamp扩增和试纸条显色反应，具有非实验室环境使用、灵敏度高、特异性强、检测速度快等特点，但lamp扩增反应、核酸酶探针切割及试纸条反应需要在不同的体系中进行，其设备装置过于复杂，容造成lamp扩增产物的扩散风险，且过于复杂的反应体系对于试剂冷冻干燥或者风干等固化处理带来了挑战。

3、lamp反应产物的检测方法主要包括：电泳法、实时荧光法、染料法以及今年来迅速发展的cas核酸酶试纸条方法。常用染料主要包括羟基萘酚蓝(hnb)、钙黄绿素、sybrgreen、酸碱指示剂等，这些染料是可视化检测技术的基础，在反应前或反应后加入反应体系，不需要专门设备，肉眼就可以判读检测结果。sybr显色法和钙黄绿素显色法显色后的绿色易受到植物叶片中叶绿素的影响，且钙黄绿素具有毒性，需要在防护条件下使用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于：现有技术中叶片的lamp-hnb检测容易收到叶绿素的影响，检测不便的问题。

2、本发明提供一种植物叶片检测方法，包括：

3、1)使用混合溶液对植物叶片进行dna粗提，得到叶片dna粗提液；

4、2)将步骤1)的叶片dna粗提液进行lamp-hnb检测；

5、所述混合溶液中含有使叶片裂解的试剂。

6、所述混合溶液为sds、tween20、triton x-100溶液中的至少一种。

7、其中，所述步骤1)中的混合溶液为质量比是1:1的sds和tween20。

8、其中，所述步骤1)中的粗提方法为：将叶片放入0.5％ sds和0.5％ tween20的混合溶液中，研磨，稀释，得到叶片dna粗提液。

9、其中，所述步骤1)中的叶片与混合溶液的比例为，每直径为6mm的叶片使用150ml-300ml的混合溶液。

10、其中，所述步骤1)中的研磨时间为10-30秒。

11、其中，所述步骤1)中的稀释倍数为10-30倍。

12、本发明还提供一种用于粗提叶片的混合溶液，所述混合溶液为将0.5％ sds和0.5％tween20按照体积比1:1比例混合得到的混合溶液。

13、所述的混合溶液在植物叶片样品基因快速检测中的应用也应在本发明的保护范围之内。

14、所述的混合溶液在制备植物叶片样品基因快速检测产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

15、基于lamp-hnb可视化技术及叶片快速处理方法，本发明提供了一种植物叶片快速基因检测方法，利用该方法30分钟内就可以完成从植物叶片处理到获得检测结果整个流程，具备方法简便快捷、特异性强、灵敏度高、成本低等特点。

技术特征：

1.植物叶片检测方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合溶液中含有sds、tween20、tritonx-100溶液中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的混合溶液为质量比是1:1的sds和tween20。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的粗提方法为：将叶片放入0.5％sds和0.5％tween20的混合溶液中，研磨，稀释，得到叶片dna粗提液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的叶片与混合溶液的比例为，每直径为6mm的叶片使用150ml-300ml的混合溶液。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的研磨时间为10-30秒。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的稀释倍数为10-30倍。

8.一种用于粗提叶片的混合溶液，其特征在于，所述混合溶液为将0.5％sds和0.5％tween20按照体积比1:1比例混合得到的混合溶液。

9.权利要求8所述的混合溶液在植物叶片样品基因快速检测中的应用。

10.权利要求8所述的混合溶液在制备植物叶片样品基因快速检测产品中的应用。

技术总结本发明公开了植物叶片检测方法，包括：1)使用混合溶液对植物叶片进行DNA粗提，得到叶片DNA粗提液；2)将步骤1)的叶片DNA粗提液进行LAMP‑HNB检测；所述混合溶液中含有使叶片裂解的试剂。利用本发明的植物叶片快速基因检测方法30分钟内就可以完成从植物叶片处理到获得检测结果整个流程，具备方法简便快捷、特异性强、灵敏度高、成本低等特点。技术研发人员：翟晨光受保护的技术使用者：北京科捷达生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/17