一种莫替福肽BL-8040的HPLC检测方法与流程

本申请涉及分析化学的，具体涉及一种莫替福肽bl-8040的hplc检测方法。

背景技术：

1、莫替福肽bl-8040是一种短肽和cxcr4拮抗剂，其在多发性骨髓瘤患者自体骨髓移植的造血干细胞动员方面的作用机制为：骨髓基质细胞中的cxcl12与造血干细胞上的cxcr4结合并保留在保护性骨髓小生境中，bl-8040通过与cxcr4结合，并具有较长时间(>48h)的受体占有率，从而阻止cxcl12和cxcr4之间的相互作用，抑制cxcr4–cxcl12途径，促进肿瘤微环境的改变，从而增强免疫治疗活性。

2、目前，莫替福肽bl-8040的制备是以rink amide-am resin为固相载体，以fmoc保护氨基酸为单体，n端使用对氟苯甲酸封端，按照固相合成的方法，逐渐缩合形成线性粗肽，然后4-13位半胱氨酸经过氧化后形成二硫键，氧化后粗肽溶液经纯化、冻干，获得莫替福肽bl-8040终产品。由此可见，上述莫替福肽bl-8040的制备过程复杂、工艺路线长，其制备过程中会产生大量的中间体(包括线性杂质、环化粗肽及大量相关杂质)，然而目前缺乏有效的中间过程控制方法。

3、因此，提出一种莫替福肽bl-8040的hplc检测方法，对于莫替福肽bl-8040的质量控制具有重要意义。

技术实现思路

1、为了实现莫替福肽bl-8040的质量控制，本申请提供一种莫替福肽bl-8040的hplc检测方法

2、本申请提供一种莫替福肽bl-8040的hplc检测方法，采用如下的技术方案：

3、一种莫替福肽bl-8040的hplc检测方法，包括以下步骤：制备供试品溶液，将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用反相c18与阴离子交换硅胶填料的混合色谱柱及流动相梯度洗脱方法进行分离检测；

4、所述流动相梯度洗脱方法为：

5、0～5min，流动相a为85％，流动相b为15％；

6、5～30min，流动相a由85％递减至75％，流动相b由15％递增至25％；

7、30～45min，流动相a由75％递减至50％，流动相b由25％递增至50％；

8、45～50min，流动相a为50％，流动相b为50％；

9、50.0～50.1min，流动相a由50％递增至85％，流动相b由50％递减至15％；

10、50.1～60min，流动相a为85％，流动相b为15％。

11、所述流动相a为磷酸盐缓冲液、流动相b为乙腈。

12、本申请根据bl-8040的结构特征，选择反相c18与阴离子交换硅胶填料的混合色谱柱，并通过调整将流动相的类型及洗脱方法，从而获得了一种专属性强、灵敏度高、稳定性好与耐用性佳的莫替福肽bl-8040的检测方法，利用上述检测方法检测莫替福肽bl-8040及相关杂质，获得的检测谱图中，莫替福肽bl-8040的主峰与其他杂质峰之间的分离效果明显，主峰与相邻杂质峰能够达到基线分离。将上述检测方法用于莫替福肽bl-8040的生产中，能实时检测制备过程中的杂质成分含量，实现莫替福肽bl-8040质量的有效把控。

13、可选地，所述流动相a为0.20～0.40mol/l的磷酸二氢钠水溶液。

14、可选地，所述磷酸二氢钠水溶液的ph值为2.0～3.0。

15、可选地，所述磷酸二氢钠水溶液的ph值是采用磷酸进行调节。

16、可选地，所述分离检测过程中流速为0.6-0.8ml/min。

17、可选地，所述分离检测过程中柱温为35±5℃

18、可选地，所述分离检测过程中检测波长为226nm。

19、可选地，所述供试品溶液的浓度为0.1～1.5mg/ml；

20、当待测样品为线性莫替福肽bl-8040粗品时，供试品溶液的制备方法为：将线性莫替福肽bl-8040粗品与三氯乙基磷酸酯溶液等体积混合，振摇50-70min，然后用水稀释，获得线性莫替福肽bl-8040粗品终浓度为0.1～1.5mg/ml的供试品溶液；其中，所述三氯乙基磷酸酯溶液的浓度为5-50mm。

21、本申请中，在线性莫替福肽bl-8040制备工艺的裂解阶段，由于空气氧化会使得部分线性莫替福肽bl-8040转化为环化莫替福肽bl-8040，导致线性莫替福肽bl-8040粗品中含有部分环化莫替福肽bl-8040；因此，在对线性莫替福肽bl-8040粗品检测时，需要采用还原剂(三氯乙基磷酸酯溶液)对其进行还原，使得体系中的环化莫替福肽bl-8040全部转化为线性莫替福肽bl-8040，从而保证线性莫替福肽bl-8040粗品检测结果的准确性。

22、可选地，所述混合色谱柱的官能团为十八烷基团和叔胺基团，碳载量为8％。

23、可选地，所述混合色谱柱为inertsustain ax-c18，规格为4.6mm×250mm，5μm。

24、综上所述，本申请具有以下有益效果：

25、1.本申请提供了一种莫替福肽bl-8040的hplc检测方法，上述检测方法通过采用混合色谱柱、并调整流动相洗脱程序，从而能够同时检测莫替福肽bl-8040以及莫替福肽bl-8040制备过程中产生的工艺杂质与降解杂质，并且检测的专属性强、灵敏度高、稳定性与耐用性好，能够实现莫替福肽bl-8040质量的有效把控，对于莫替福肽bl-8040的批量化生产及使用安全性具有重要意义。

26、2.利用本申请提供的莫替福肽bl-8040的hplc检测方法对莫替福肽bl-8040终产品进行检测，获得的检测谱图中主峰的峰高适宜、莫替福肽bl-8040峰与杂质峰之间的分离效果好，莫替福肽bl-8040峰与相邻杂质峰能够达到基线分离。

27、3.本申请为莫替福肽bl-8040工业化生产建立了完善的科学化、规范化的分析测试方法，该莫替福肽bl-8040的hplc检测方法具有重大的实际意义和学术价值。

28、4.利用本申请提供的莫替福肽bl-8040的hplc检测方法检测莫替福肽bl-8040，莫替福肽bl-8040的检测限浓度为0.5μg/ml。

技术特征：

1.一种莫替福肽bl-8040的hplc检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：制备供试品溶液，将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用反相c18与阴离子交换硅胶填料的混合色谱柱及流动相梯度洗脱方法进行分离检测；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相a为0.20~0.40mol/l的磷酸二氢钠水溶液。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠水溶液的ph值为2.0~3.0。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠水溶液的ph值是采用磷酸进行调节。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述分离检测过程中流速为0.6-0.8ml/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述分离检测过程中柱温为35±5℃。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述分离检测过程中检测波长为226nm。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的浓度为0.1~1.5mg/ml；

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述混合色谱柱的官能团为十八烷基团和叔胺基团，碳载量为8%。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述混合色谱柱为inertsustainax-c18，规格为4.6mm×250mm，5μm。

技术总结本申请涉及分析化学技术领域，具体公开了一种莫替福肽BL‑8040的HPLC检测方法。本申请提供的莫替福肽BL‑8040的HPLC检测方法，包括以下步骤：制备供试品溶液，将供试品溶液注入高效液相色谱仪，采用反相C18与阴离子交换硅胶填料的混合色谱柱及流动相梯度洗脱方法进行分离检测，其中流动相梯度洗脱方法中，流动相A为磷酸盐缓冲液、流动相B为乙腈；进一步地，分离检测过程中流速为0.6‑0.8mL/min，柱温为35±5℃，检测波长为226nm。本申请提供的莫替福肽BL‑8040的HPLC检测方法能够用于莫替福肽BL‑8040的生产制备过程中，实现莫替福肽BL‑8040产品质量的有效把控。技术研发人员：赵佳欣,齐硕,赵萌,马胜楠,孔双泉受保护的技术使用者：北京赛升药业股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/10/17