巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系及制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用与流程

本发明属于生物医学工程领域，特别是涉及一种巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系及制备方法与应用。

背景技术：

1、溶瘤病毒治疗是一种新兴的癌症免疫治疗方式。溶瘤病毒(oncolytic viruses，ovs)在瘤内给药后选择性地在肿瘤细胞中复制，可以诱导肿瘤特异性炎症反应杀死肿瘤细胞，而不会在正常组织中繁殖。尽管肿瘤内给药确保了直接进入肿瘤病变，避免了潜在的全身中和，但ovs的全身给药对于临床适应症更实用。增强ovs向肿瘤传递的努力利用了具有固有肿瘤亲和性的活细胞，如t细胞或间充质干细胞作为ovs载体。另一种方法是使用生物材料或纳米载体，如脂质体或细胞膜。基于细胞的策略很大程度上依赖于宿主细胞对ovs的内化，通常仅限于特定类型的病毒。对于被宿主细胞内吞的ovs，目前尚不清楚这些载体细胞如何在到达肿瘤后将内化的病毒胞吐出来，而ovs感染的宿主细胞表现出较低的增殖和逐渐降低的活力，潜在地损害了它们对肿瘤的效应功能。基于生物材料的载体，无论是有机的还是无机的，都可以通过化学或物理方式装载ovs，并在肿瘤微环境(tme)的刺激下释放ovs，但它们中的大多数存在临床不可用、快速清除和被健康组织非特异性吸收的问题。

2、巨噬细胞是人类先天免疫反应的关键组成部分，也是肿瘤微环境(tme)中最丰富的免疫细胞。它们可以通过追踪肿瘤细胞分泌的csf-1和ccl2等细胞因子以及通过肿瘤部位表达的粘附分子-1(vcam-1)与巨噬细胞α4整合素的相互作用向肿瘤迁移。其中，m1极化巨噬细胞参与抗肿瘤免疫，其特点是具有吞噬功能，定义为cd63+cd86+，它们的炎症活性涉及各种炎症分子，如il-1、il-12和il-23、tnfa和趋化因子配体(cxcl5、cxcl9和cxcl12)，以及通过主要组织相容性复合体分子(mhc 1类和2类)呈递肿瘤特异性抗原。

3、但目前，尚未有巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系并用于制备抗肿瘤药物的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系。

2、本发明的第二个目的是提供巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系的制备方法。

3、本发明的第三个目的是提供巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系在制备抗肿瘤药物中的应用。

4、本发明的技术方案概述如下：

5、巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系的制备方法，包括如下步骤：

6、1)将二甲基咪唑和二氨基苯并咪唑混合，溶于有机溶剂得溶液a；将六水硝酸锌溶于有机溶剂得溶液b，将溶液b加入溶液a中，搅拌下反应，得到zif-8-nh2；将zif-8-nh2溶于有机溶剂中，得到zif-8-nh2溶液；将zif-8-nh2溶液、dbco-acid、edc和nhs混合，在搅拌下反应，离心，干燥，得到zif-8-dbco，溶解在pbs中；

7、所述zif-8-nh2是氨基化的沸石咪唑骨架-8的简写；

8、所述dbco-acid是二苯基环辛炔-羧酸的简写；

9、所述edc是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的简写；

10、所述nhs是n-羟基琥珀酰亚胺的简写；

11、所述zif-8-dbco是dbco修饰的沸石咪唑骨架-8的简写；

12、2)将zif-8-dbco的pbs溶液与简称为oa的溶瘤腺病毒oncolytic adenovirus，在4℃，搅拌10-12h，离心，收集，得到zifoa，溶解在pbs中；

13、3)将raw264.7细胞系、lps和ifn-γ共孵育20-24h，得到m1型巨噬细胞，再与ac4mannaz共孵育2-3天，得到简称为ma-n3的表面生成叠氮基团的m1型巨噬细胞；

14、4)将步骤2)得到的zifoa的pbs溶液和步骤3)得到的ma-n3通过环加成反应0.5-1h，得到巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系，简称ma@zifoa；

15、所述raw264.7细胞系是小鼠单核巨噬细胞白血病细胞；

16、所述lps是脂多糖的简写；

17、所述ifn-γ是干扰素-γ的简写；

18、所述ac4mannaz是1,3,4,6-四-o-乙酰基-n-叠氮乙酰基氨基甘露糖的简写。

19、优选地，步骤1)的二甲基咪唑、二氨基苯并咪唑和六水硝酸锌的摩尔比为10：6.7：1。

20、所述zif-8-nh2、dbco-acid、edc和nhs的质量比为50：10：6：4。

21、有机溶剂优选甲醇、乙醇或二甲基甲酰胺。

22、上述制备方法制备的巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系。

23、上述巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系在制备抗肿瘤药物中的应用。

24、上述应用，所述肿瘤优选为乳腺癌。

25、本发明的优点：

26、实验证明，本发明的巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系对4t1细胞(小鼠乳腺癌细胞)有明显抑制作用。

27、本发明的巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系稳定，生物相容性良好。本发明的方法简单便捷、稳定。

28、本发明的巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系既能增强oa向肿瘤的靶向递送，又能增强t细胞介导的免疫应答。

技术特征：

1.巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述步骤1)的二甲基咪唑、二氨基苯并咪唑和六水硝酸锌的摩尔比为10：6.7：1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述zif-8-nh2、dbco-acid、edc和nhs的质量比为50：10：6：4。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述有机溶剂为甲醇、乙醇或二甲基甲酰胺。

5.权利要求1-4之一的制备方法制备的巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系。

6.权利要求5的巨噬细胞-溶瘤病毒偶联体系在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征是所述肿瘤为乳腺癌。

技术总结本发明公开了巨噬细胞‑溶瘤病毒偶联体系及制备方法与在制备抗肿瘤药物中的应用，制备为：制备ZIF‑8‑NH<subgt;2</subgt;；将ZIF‑8‑NH<subgt;2</subgt;、DBCO‑Acid、EDC和NHS反应，得到ZIF‑8‑DBCO；将溶瘤腺病毒与ZIF‑8‑DBCO一起搅拌，使得溶瘤病毒包封在ZIF‑8中得到ZIFOA；将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞刺激为M1型巨噬细胞，将M1巨噬细胞与Ac4ManNAz共孵育得到MA‑N<subgt;3</subgt;；ZIFOA和MA‑N<subgt;3</subgt;通过环加成反应，得到巨噬细胞‑溶瘤病毒偶联体系，本发明体系稳定，生物相容性好，制备方法简单，该体系对4T1细胞有明显抑制作用；既能增强OA向肿瘤的靶向递送，又能增强T细胞介导的免疫应答。技术研发人员：邓俊杰,王继龙,卢宁受保护的技术使用者：国科温州研究院（温州生物材料与工程研究所）技术研发日：技术公布日：2024/11/4