一种构建原核生物单细胞RNA测序文库的方法与流程

本发明属于基因测序，具体地，涉及一种针对原核生物单细胞的rna测序文库构建方法。

背景技术：

1、随着基因测序技术的不断进步，rna测序已成为生物学和医学研究中的重要工具。特别是单细胞rna测序技术的发展，极大地提升了研究的细节和深度，使得研究者能够获得单个细胞级别的表达模式。然而，现有的单细胞rna测序技术主要针对真核生物，对原核生物的应用仍然面临技术挑战。

2、原核生物在不同条件下表现出的基因表达异质性，如抗生素耐药性，往往局限于极少数细胞，而群体水平的基因表达测量无法揭示这些重要的生物学现象。尽管split-seq、petri-seq、bacdrop和m3-seq等方法为原核生物单细胞转录组学提供了一定的解决方案，但这些方法在去除rrna、提高特异性和降低实验复杂性及成本方面仍有待改进。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提出了一种原核生物单细胞rna测序文库的高效、低成本构建方法。该方法通过特定技术手段，有效去除rrna，同时简化实验步骤，降低成本，提高了原核生物单细胞rna测序的效率和准确性。

2、为了实现上述目的，本发明提供一种低成本简便的构建原核生物单细胞rna测序文库的方法，流程如图1所示，包括下述步骤：

3、（1）细胞处理：固定原核生物细胞，并进行细胞膜透化。

4、根据一种优选实施方式，固定的原核生物细胞的数量为1-1020个，更优选为105-109个，最优选为1000万个。

5、固定和透化优选在1-4℃的低温下进行，且添加rnase抑制剂。

6、（2）polya添加与rrna屏蔽：通过poly a聚合酶给rna片段3’末端加上polya序列，同时通过屏蔽引物特异性地阻断rrna末端被加入polya序列；借助poly a聚合酶仅对单链rna 3’末端进行atp渗入的特性，借助阻断引物区分rrna和其他rna；所述屏蔽引物的序列为seq id no.1~13所示。

7、所述屏蔽引物包括基本屏蔽引物、热点屏蔽引物和人类组织细胞屏蔽引物。其中，

8、基本屏蔽引物：

9、针对5s rrna：

10、5’-atgcctggcagttccctactctcgcatggg-3’（seq id no.1）

11、针对16s rrna：

12、5’-taaggaggtgatccaaccgcaggttcccct-3’（seq id no.2）

13、针对23s rrna：

14、5’-aaggttaagcctcacggttcattagtaccg-3’（seq id no.3）

15、热点屏蔽引物：seq id no.4至9详细描述了针对16srrna和23s rrna的热点区域的屏蔽引物。

16、针对16s热点107：

17、5’-ggcacatccgatggcaagaggcccgaaggt-3’（seq id no.4）

18、针对16s热点682：

19、5’-tcctgtttgctccccacgctttcgcacctg-3’（seq id no.5）

20、针对16s热点1241：

21、5’-ccgtggcattctgatccacgattactagcgattccg-3’（seq id no.6）

22、针对23s热点375：

23、5’-cgcctttccctcacggtactggttcactatcgg-3’（seq id no.7）

24、针对23s热点1421：

25、5’-ttgcttcagcaccgtagtgcctcgtcatca-3’（seq id no.8）

26、针对23s热点1641：

27、5’-gcagccagctggtatcttcgactgatttcagc-3’（seq id no.9）

28、人类组织细胞屏蔽引物：用于同时对人体组织细胞和细菌进行单细胞rna测序的屏蔽引物，如seq id no.10至13所示。

29、18srrna屏蔽引物

30、5’-taatgatccttccgcaggttcacctacgga-3’（seq id no.10）

31、18s rrna热点屏蔽引物

32、5’-cactaagccattcaatcggtagtagcgacg-3’（seq id no.11）

33、28s rrna屏蔽引物

34、5’-gacaaacccttgtgtcgagggctgactttcaatag-3’（seq id no.12）

35、5.8s rrna屏蔽引物

36、5’-aagcgacgctcagacaggcgtagccccggg-3’（seq id no.13）

37、步骤（2）中poly a聚合酶与屏蔽引物最好同时加入，且屏蔽引物的最终浓度为1~100 μm，优选为40~60μm，最优选为50 μm。

38、（3）反转录与第一轮标签添加：使用带有特定标签的核苷酸序列对添加polya的rna序列进行反转录，得到cdna序列；所述带有特定标签的核苷酸序列为seq id no.14所示：5’-/5phos/gccagabbbbbbbnnnnnntttttttttttttttttttttttttv-3’ （seq id no.14）。

39、其中6个n代表随机组合的umi标签，7个b代表由atcg碱基构成的barcode标签（每个孔对应一个7个碱基barcode标签序列），v代表碱基c、g或a，gccaga为通用序列，用于第二轮标签连接时与接头互补。

40、（4）第二轮标签添加：通过连接反应，利用互补连接接头序列将第二轮标签序列添加至第一轮得到的cdna序列上，以进一步提高细胞umi数量；所述互补连接接头序列为seqid no.15所示，所述第二轮标签序列为seq id no.16所示。

41、互补连接接头序列：5’-tctggcgtaggaggtcgtc-3’（seq id no.15）

42、其中5’端tctggc与反转录引物的5’端的gccaga反向互补，gtaggagg部分与第二轮标签序列的3’端反向互补，最后4个碱基与第二轮标签序列不互补。

43、第二轮标签序列：5’-gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctbbbbbbbtcgccctcctac-3’（seq id no.16）

44、其中gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct部分为illumina的测序接头序列，可以根据需要替换为其他测序平台的接头序列，7个b为atcg碱基构成的barcode标签。

45、根据本发明，第二轮标签序列与互补连接接头序列需要首先完成低温退火，再加入体系中。互补连接接头序列（seq id no.15）和第二轮标签序列（seq id no.16）的设计，确保了低温退火过程的顺利进行，并避免了后续延伸导致的不必要的反向互补问题。

46、根据本发明的方法，步骤（4）中可根据细胞数量增加一轮标签，以优化测序效率和准确性。

47、（5）扩增与第三轮标签添加：使用带有标签的随机引物对步骤（4）得到的cdna序列进行第二链生成并添加第三轮标签。

48、根据一种优选实施方式，该步设计的随机引物+第三轮标签序列如下：5’-tacactctttccctacacgacgctcttccgatctbbbbbbbggtccttgnnnnnn-3’（seq id no.17）。

49、其中bbbbbbb为barcode标签序列，nnnnnn为随机引物。tacactctttccctacacgacgctcttccgatct部分为illumina的另一侧测序接头序列，可以根据需要替换为其他测序平台的接头序列。

50、本发明的barcode标签序列可从如下序列中选择：

51、

52、（6）文库构建与扩增：对步骤（5）所得产物进行纯化处理后，通过测序通用引物进行扩增，构建适用于测序的文库。

53、根据本发明一种实施方式，步骤（6）中的纯化处理采用ampure xp磁珠，以去除100bp以下的片段和引物接头序列。

54、根据本发明一种实施方式，步骤（6）中的所述测序通用引物为illumina测序双端接头引物。

55、根据本发明的方法，步骤（3）~（5）的反应均分装多孔板进行，相应的下一步先将分装的各孔混合，再分装多孔板进行该下一步反应。例如，步骤（3）的反转录分装多孔板（例如96孔板或384孔板）进行，步骤（4）先将分装的各孔混合，对细胞液进行处理，再次分装多孔板进行第二轮标签添加，步骤（5）也先将细胞汇集到一个管中，对细胞液进行处理，再分装多孔板进行第二链合成与第三轮标签添加，步骤（6）同样先将反应物混合，再进行纯化和扩增建库。

56、本发明的方法可适用于所有的原核生物，例如粪便肠道菌群或其他培养的原核生物菌株。所述粪便肠道菌群包括但不限于大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、沙门氏菌等。

57、本发明通过以上步骤，实现了一种简便、高效的原核生物单细胞rna测序文库的构建方法，为原核生物的单细胞表达研究提供了有力的技术支持。

58、本发明的方法利用polya聚合酶特异性为单链rna的3’末端添加polya序列的特点，并通过设计的封闭引物特异性地阻断rrna的3’末端，从而有效去除rrna的干扰。该方法的关键在于通过几条特定的封闭引物，就能针对几乎所有原核生物的rrna进行有效的结合和封闭，极大地简化了实验步骤并降低了成本。此外，本发明还可通过设计针对人类及其他真核生物rrna的封闭引物，实现原核生物和真核生物单细胞rna的同时测序。

59、本发明通过polya聚合酶的选择性添加polya的特性，无需单独rrna去除步骤，简单的通过少数几条屏蔽引物即可去除绝大部分单细胞原核rna测序文库中rrna并完成原核mrna的polya添加。本发明使用vtn引物进行选择性反转录结合随机引物实现低成本、步骤简单的完成单细胞文库构建。此外，通过改变屏蔽引物序列还可拓展到同时对原核和真核生物进行单细胞rna建库。

60、本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。