一种疫苗毒株鉴定的引物探针组合、试剂盒及应用的制作方法

本发明属于生物检测，具体涉及一种疫苗毒株鉴定的引物探针组合、试剂盒及应用。

背景技术：

1、狂犬病是由狂犬病病毒引发的一种严重的人兽共患病，该病毒严重侵袭中枢神经系统，并进而导致脑部和脊髓出现持续恶化、甚至致命的炎症症状。狂犬病病毒是一种rna病毒，病毒进入人体后首先在被咬伤的肌肉组织中复制，然后侵入神经系统进入脑部，进一步破坏呼吸和循环系统。狂犬病潜伏期长，一旦发作死亡率接近100%。因此，确保人用狂犬病疫苗的有效性、安全性对于降低狂犬病死亡率具有重要的意义。

2、我国生产的大量人用狂犬病疫苗所使用的狂犬病病毒毒株为pv。狂犬病病毒毒株变异会影响疫苗生产的工艺稳定性和产品的一致性，还可能导致其在生物学特性、致病性等方面存在差异，进而影响到疫苗的保护效果。因此对不同代次的疫苗毒株进行准确高效的检测，对于提高疫苗的质量控制水平、确保疫苗的安全性和最佳保护效果至关重要。pv的rna编码核蛋白（n）、磷蛋白（p）、基质蛋白（m）、糖蛋白（g）和rna多聚酶（l）五种蛋白，其中g蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原，可有效刺激特异性辅助性t细胞和细胞毒性t细胞增生，并诱导机体产生特异性抗体。n基因在pv基因组中相对恒定，点突变较少，因此提供了较好的定量分辨率，是基因分型的主要依据。

3、一步法数字pcr能够直接数出rna分子的个数，无需单独进行反转录扩增，实现对起始样品的绝对定量。与qpcr相比，数字pcr不依赖于扩增曲线的循环阈值（ct）或标准曲线，结果更为准确可靠，灵敏度更高，对于复杂背景下稀有突变的检测和表达量微小差异分析的优势更为突出。

4、《中国药典》三部中收录的人用狂犬病疫苗毒株鉴别方法采用鼠脑内中和试验，此种方法需要牺牲动物，不利于动物保护，传统的普通rt-pcr检测存在交叉污染风险，且操作复杂，而实时荧光定量rt-pcr在对病毒定量时需要依靠标准品，容易受到标准品的影响。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种疫苗毒株鉴定的引物探针组合、试剂盒及应用，提高了检测的速度、特异性、准确性以及灵敏度，能够在毒株鉴定中发挥重要作用。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种疫苗毒株鉴定的引物探针组合，所述的引物探针组合为特异性引物探针组合1和特异性引物探针组合2；

4、所述的特异性引物探针组合1包括序列如seq id no.1所示的正向引物、序列如seq id no.2所示的反向引物、序列如seq id no.5所示的探针；

5、所述的特异性引物探针组合2包括序列如seq id no.6所示的正向引物、序列如seq id no.7所示的反向引物、序列如seq id no.11所示的探针。

6、进一步地，所述的序列如seq id no.5所示的探针、序列如seq id no.11所示的探针5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有猝灭基团。

7、进一步地，所述的荧光基团为fam；所述的猝灭基团为vic。

8、本发明中，公开了疫苗毒株鉴定的试剂盒，包括特异性引物探针组合1和特异性引物探针组合2。

9、本发明中，所述的疫苗毒株鉴定的引物探针组合在制备人用狂犬病疫苗毒株检测试剂中的应用。

10、进一步地，人用狂犬病疫苗毒株检测试剂的使用方法包括以下步骤：

11、（1）获得待测样品的rna模板；

12、（2）配制数字pcr反应体系；

13、（3）将步骤（2）配制的数字pcr反应体系进行数字pcr扩增，读取微滴信号，判断待测样品是否为人用狂犬病疫苗毒株。

14、进一步地，根据步骤（3）中的微滴信号，如果两组特异性引物探针组合均检测到微滴信号的荧光，则证明待测样品为人用狂犬病疫苗毒株；按照泊松分布原理计算获得微滴pcr反应体系内狂犬病病毒dna的拷贝数，得到对应病毒的定量结果。

15、进一步地，步骤（2）中所述的pcr反应体系的组成为：absolute q™ 1-step rt-dpcr master mix (4x) 10.0μl，10μmol/ l正向引物0.5μl，10μmol/ l反向引物0.5μl，10μmol/ l探针1μl，rna模板2.0μl，rna-free 水补足至40μl。

16、进一步地，步骤（3）中所述的数字pcr扩增程序为：55℃ 10min；96 ℃ 10min；96℃5s，60℃ 10s，40个循环；4℃保存，升降温速率为2 ℃/s。

17、有益效果

18、本发明创新性将人用狂犬病疫苗毒株pv鉴定的特异性引物与探针组合，利用一步法微滴数字pcr技术，解决了传统方法中先进行反转录操作的复杂性，易污染的问题，实现了对人用狂犬病疫苗毒株的准确检测；此方法不仅展现出卓越的特异性，还具备极高的灵敏度，可实现病毒量的绝对定量，省去了传统方法中繁琐的标准曲线构建步骤，大大简化了操作流程，提高了检测效率，有助于显著提升人用狂犬病疫苗的质量控制水平，保证人用狂犬病疫苗在临床用药中的有效性和安全性。

技术特征：

1.一种疫苗毒株鉴定的引物探针组合，其特征在于，所述的引物探针组合为特异性引物探针组合1和特异性引物探针组合2；

2. 根据权利要求1所述的疫苗毒株鉴定的引物探针组合，其特征在于，所述的序列如seq id no.5所示的探针、序列如seq id no.11所示的探针5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有猝灭基团。

3.根据权利要求2所述的疫苗毒株鉴定的引物探针组合，其特征在于，所述的荧光基团为fam；所述的猝灭基团为vic。

4.一种疫苗毒株鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的特异性引物探针组合1和特异性引物探针组合2。

5.一种权利要求1~3任一项所述的疫苗毒株鉴定的引物探针组合在制备人用狂犬病疫苗毒株检测试剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，人用狂犬病疫苗毒株检测试剂的使用方法包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，根据步骤（3）中的微滴信号，如果两组特异性引物探针组合均检测到微滴信号的荧光，则证明待测样品为人用狂犬病疫苗毒株；按照泊松分布原理计算获得微滴pcr反应体系内狂犬病病毒dna的拷贝数，得到对应病毒的定量结果。

8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述的pcr反应体系的组成为：absolute q™ 1-step rt-dpcr master mix (4x) 10.0μl，10μmol/ l正向引物0.5μl，10μmol/ l反向引物0.5μl，10μmol/ l探针1μl，rna模板2.0μl，rna-free 水补足至40μl。

9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（3）中所述的数字pcr扩增程序为：55℃ 10min；96 ℃ 10min；96℃ 5s，60℃ 10s，40个循环；4℃保存，升降温速率为2 ℃/s。

技术总结本发明公开了一种疫苗毒株鉴定的引物探针组合、试剂盒及应用，属于生物检测技术领域。引物探针组合为特异性引物探针组合1和/或特异性引物探针组合2；特异性引物探针组合1包括序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.5所示的探针；特异性引物探针组合2包括序列如SEQ ID NO.6所示的正向引物、序列如SEQ ID NO.7所示的反向引物、序列如SEQ ID NO.11所示的探针。本发明创新性将人用狂犬病疫苗毒株PV鉴定的特异性引物与探针组合，利用一步法微滴数字PCR技术，解决了传统方法中先进行反转录操作的复杂性，易污染的问题，展现出特异性和灵敏度，提高了检测效率，保证人用狂犬病疫苗在临床用药中的有效性和安全性。技术研发人员：梁超超,咸瑞卿,巩丽萍,石峰,王维剑,杭宝建,王夙博,王聪聪受保护的技术使用者：山东省食品药品检验研究院技术研发日：技术公布日：2024/11/4