一种香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法

本发明属于植物组培，具体涉及一种香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法。

背景技术：

1、香石竹（ dianthus caryophyllus l.），又名康乃馨，属于石竹科（ caryophyllaceae）石竹属（ dianthus），是一种多年生草本植物。香石竹为雌雄同花，但由于栽培品种的重瓣程度较高，雄蕊数量稀少，且大多深藏在花瓣内部，甚至有些品种的雄蕊已经败育。现有的香石竹再生技术通常通过切取不同的外植体材料来诱导愈伤组织，再将愈伤组织分化出芽、生根后炼苗并移栽。这一过程首先需要对外植体进行消毒，但由于具有较强再生能力的外植体通常较为幼嫩，在消毒过程中若消毒不彻底，容易导致污染，而消毒过度又可能导致幼嫩材料死亡。因此，通常先获得无菌苗，再通过扦插方式进行繁殖。但经过多次继代，无菌苗的繁殖系数会降低，植株的长势减弱，且随着时间的推移，植株可能出现病毒累积效应，导致开花质量下降。此外，通过无菌苗切取外植体来诱导愈伤组织并分化出芽的过程，耗时较长，且成苗率低。因此，对香石竹的高效再生技术进行研究是非常有必要的。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法，本发明所述方法构建的高效再生体系实现了香石竹快速、稳定、高效的育种。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法，包括以下步骤：

4、（1）种子的消毒灭菌：香石竹种子先用75%的酒精浸泡后用无菌水漂洗，再用3%的次氯酸钠溶液浸泡后用无菌水漂洗，然后去除种子表面的水分，接种到ms+30g/l糖+8g/l琼脂、ph=6±0.2的基础培养基上。

5、（2）种子萌发：接种到基础培养基上的种子先置于黑暗条件下、25±2℃培养至种子开始萌发，将萌发的种子转移到光照条件下，于25±2℃、光周期16h、光照强度36μmol·m-2·s-1培养至得到香石竹幼苗。

6、（3）愈伤组织的诱导：取香石竹幼苗，切取下胚轴，放于ms+30g/l糖+8g/l琼脂+1-5mg/l 2,4-d+10-6-10-8mol/l psk的愈伤诱导培养基，置于黑暗环境、25±2℃条件下，诱导培养至产生愈伤组织。

7、（4）胚性愈伤组织诱导：将诱导产生的愈伤组织转移到ms+30g/l糖+8g/l琼脂+0.5-2.5mg/l 6-ba+0.1-2.0mg/l naa的胚性愈伤诱导培养基上，在光照条件下，25±2℃、光周期16h、光照强度36μmol·m-2·s-1诱导培养至产生胚性愈伤组织。

8、（5）胚性愈伤组织的分化：将诱导出的胚性愈伤组织切碎后置于ms+30g/l糖+8g/l琼脂+0.5-2.5mg/l naa+0.1-2.0mg/l tdz+0.5-2.5mg/l kt的分化培养基中，在光照条件下，25±2℃、光周期16h、光照强度36μmol·m-2·s-1进行分化培养，培养至体细胞胚分化成芽。

9、（6）生根培养：将子叶发育良好的子叶胚从胚性愈伤组织上分离，接种于ms+30g/l蔗糖+8g/l琼脂、ph=6±0.2的生根培养基中，在光照强度为40μmol·m-2·s-1、光周期16h、23±2℃的条件下培养至生根。在再生苗生根后，将泥炭土和珍珠岩按质量比为2:1混合的基质置于穴盘中，将生根苗栽植于穴盘中，适应自然环境后定植。

10、与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

11、1、本发明建立了一个高效的香石竹体细胞胚再生体系，单个胚性愈伤体胚诱导数达1600多个，为香石竹基因工程育种提供高效的基于体胚发生的遗传转化体系。

12、2、本发明可以实现对香石竹大量繁殖健康植株，有效避免传统扦插繁殖中的病毒累积效应，从而提高无性繁殖的繁殖效率和成苗质量。

技术特征：

1.一种香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法，其特征在于，步骤（1）至步骤（4）中培养温度为25±2℃，步骤（5）中培养温度为23±2℃。

3.根据权利要求1所述的香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法，其特征在于，步骤（1）、步骤（3）、步骤（4）中光照培养步骤的光周期为16h，光照强度为36μmol·m-2·s-1；步骤（5）中光照培养步骤的光周期为16h，光照强度为40μmol·m-2·s-1。

4.根据权利要求1所述的香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法，其特征在于，步骤（1）所述的消毒灭菌步骤为：将香石竹种子先用75%的酒精浸泡后用无菌水漂洗，再用3%的次氯酸钠溶液浸泡后用无菌水漂洗，然后去除种子表面的水分。

5.根据权利要求1所述的香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法，其特征在于，步骤（5）中所述基质由泥炭土和珍珠岩按质量比为2:1混合而成。

技术总结本发明公开一种香石竹体细胞胚高效再生体系的构建方法，包括种子萌发、愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织的分化、生根培养等步骤。本发明所述方法构建的高效再生体系实现了香石竹快速、稳定、高效的育种。技术研发人员：金春莲,刘梦玲,孙丹,李帆,袁翎凌,张佩华受保护的技术使用者：云南省农业科学院花卉研究所技术研发日：技术公布日：2024/11/4