一种基于特殊氮源甲酰胺的非灭菌油脂发酵方法

本发明涉及产油微生物培养，特别提出了一种以特殊氮源——甲酰胺进行非灭菌发酵产油脂的创新方法。该方法旨在优化微生物油脂的生产过程，提高油脂产量和品质，同时降低生产成本和环境压力。

背景技术：

1、随着全球对可持续发展路径的迫切需求日益增长，脂质衍生的生物燃料作为绿色能源转型的重要一环，正逐步从实验室走向产业化应用的前沿。这类生物燃料不仅以其高于传统生物乙醇的能量密度著称，能够显著提升燃油效率和车辆续航能力，还因其化学结构与石油基燃料相似，使得现有内燃机技术无需大规模改造即可兼容使用，大大降低了推广成本和技术门槛。更为重要的是，脂质衍生的生物燃料的生产原料来源广泛且可再生，包括植物油、藻类、农业废弃物及城市生物质垃圾等，有效缓解了对有限化石资源的依赖，并促进了农业废弃物的资源化利用和循环经济的发展。通过先进的生物转化技术，如微生物发酵、化学催化转化等，这些原料能够被高效转化为高品质的生物柴油、生物航空煤油及生物氢气等，为交通、航空、电力等多个领域提供清洁、低碳的能源解决方案。此外，脂质衍生的生物燃料在环境友好性方面也展现出巨大优势。其生命周期中的碳排放远低于化石燃料，尤其是在闭环生产系统中，通过种植能源作物吸收二氧化碳，并在燃料使用过程中释放，形成碳循环，有助于减轻全球变暖压力。同时，减少化石燃料的使用也意味着减少了硫化物、氮氧化物等有害物质的排放，对改善空气质量、保护生态环境具有重要意义。微生物油脂还可应用于食品、医疗等多个领域，如解脂耶氏酵母转化廉价工业脂质产可可黄油替代品。尽管脂质生物燃料的巨大潜力引人瞩目，但其高昂的生产成本却成为了商业化道路上的一大障碍。为了跨越这一挑战，研究人员正不遗余力地聚焦于探索低成本碳源与开发高效发酵策略，旨在加速微生物油脂的商业化进程。

2、在碳源方面，研究人员致力于挖掘并优化各类低成本、可持续的原料资源，如农林业残留物和工业副产品，如木质纤维素、生物柴油衍生的甘油、废水和挥发性脂肪酸(vfa)。通过先进的预处理和转化技术，这些原本被视为“废物”的原料被转化为微生物生长所需的优质碳源，不仅降低了生产成本，还促进了资源的循环利用，实现了经济效益与环境效益的双赢。除了底物外，灭菌过程中的能耗也是影响生产成本的重要因素。工业发酵前通常使用高温蒸汽灭菌，防止微生物污染造成经济损失。该过程遵循的标准是，将原料和培养基从室温加热到121℃，然后持续15至60分钟以达到无菌状态。这个过程不仅需要大量的蒸汽和设备，还会导致营养物质的破坏，甚至产生一些对菌株有害的组分。在生物质快速热解过程中，纤维素和半纤维素都会产生如5-羟甲基糠醛(5-hmf)、糠醛(ff)等有害呋喃衍生物，这些副产物对微生物菌株的生长及目标产物(如蛋白质、脂质)的合成具有显著抑制作用，而非灭菌发酵有望解决以上问题。一些生物燃料和化学品已在非无菌条件下成功生产，这是通过利用特殊微生物耐受恶劣条件或吸收不常见的常量营养素来源的能力作为选择性特性来实现的。甲酰胺具有作为碳、氮和能量来源的潜力，支持微生物的生长以用于生物技术应用。在发酵生产中添加甲酰胺作为氮源，虽然不能保证完全无污染的非无菌培养并且需要适当的表达水平，但却提供了一种有前途的工具来确保甲酰胺酶阳性菌株的充分优势。

技术实现思路

1、鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种基于特殊氮源甲酰胺的非灭菌油脂发酵方法，旨在解决提高产油微生物的油脂积累效率和培养纯度，同时降低生产成本。

2、所述通过利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

3、步骤s1：活化产油酵母，并将酵母接种于种子培养基中，制备酵母种子液；

4、步骤s2：配制油脂发酵培养基，添加一定浓度的碳源，0.5-4.0g/l的甲酰胺作为氮源，再添加适量的其他营养物质，并调整ph，培养基无需灭菌；

5、步骤s3：将步骤s1所得种子液接种至步骤s2所配制的未灭菌油脂发酵培养基中，在一定温度下非灭菌通气培养一段时间，待培养基中的碳源总浓度低于3g/l时，终止发酵；

6、步骤s4:固液分离收集含油菌体，提取胞内油脂。

7、具体地，步骤s1中，所用产油酵母为毛孢子油脂酵母或弯曲隐球酵母野生菌，也可以是其自然或人工突变株。

8、具体地，步骤s1中，步骤s1中所用产油种子培养基为yepd培养基，也可以是其它营养丰富适合酵母生长的培养基。

9、具体地，步骤s2中，碳源为葡萄糖、木糖、甘油等化合物，也可以是富含这些碳源的木质纤维素水解液或粗甘油等廉价原料，碳源的初始浓度为40-100g/l。

10、具体地，步骤s2中，其他营养物质为产油酵母生长繁殖所需的必须营养成分，如磷酸二氢钾，七水硫酸镁。

11、具体地，步骤s3中，产酶酵母种子液按照接种量2％～10％(v/v)接入培养基中进行发酵，这里v/v为体积比。发酵ph范围为5.5-6.5，温度范围为25-32℃。

12、具体地，步骤s3中，苯甲酰胺可以被产油酵母彻底代谢。

13、具体地，步骤s3中，该酵母能够积累大量油脂，油脂得率在0.2-0.25g/g之间。

14、具体地，步骤s3中，当较高浓度的甲酰胺作为主要氮源，整个发酵过程可以在非灭菌条件下进行，且不会污染杂菌。

15、具体地，步骤s4中，抽提所获油脂为一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂，适合作为生物柴油的原料。

16、本发明的有益效果是：

17、1、在本发明中，甲酰胺作为氮源，能被特定的微生物如毛孢子油脂酵母有效利用，促进微生物的快速生长和繁殖。在培养基中添加少量的甲酰胺，微生能够迅速积累大量油脂，并且提高油脂的生产得率。

18、2、甲酰胺自身具备抗菌特性，这意味着在发酵过程中，即使不在严格的无菌环境下操作，也能有效抑制杂菌的生长，从而简化了发酵前的无菌处理步骤。非灭菌发酵省去了昂贵的无菌设备和操作成本，使得整个生产过程更加经济高效。

19、3、甲酰胺的代谢产物甲酸具有作为潜在碳源的潜力，实现了原料的全物质循环利用，提高了资源利用效率。通过全物质利用，减少了发酵过程中的废物产生，有利于环境保护和可持续发展。

20、本发明所采用的方法操作简单，容易实现，解决了一个发酵产油成本高和资源利用的关键问题，且显著简化了工艺流程、降低了试剂和设备成本、提升了微生物油脂生产的技术经济性，具有广阔应用前景，本发明所获油脂为一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂，可用于制备生物柴油或其他高附加值产品，具有非常好的应用价值。

技术特征：

1.一种基于特殊氮源甲酰胺的非灭菌油脂发酵方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

2.如权利要求1所述利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s1中，所用产油酵母为毛孢子油脂酵母或弯曲隐球酵母野生菌，也可以是其自然或人工突变株。

3.如权利要求1所述利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s1中，步骤s1中所用产油种子培养基为yepd培养基，也可以是其它营养丰富适合酵母生长的培养基。

4.如权利要求1所述利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s2中，碳源为葡萄糖、木糖、甘油等化合物，也可以是富含这些碳源的木质纤维素水解液或粗甘油等廉价原料，碳源的初始浓度为40-100g/l。

5.如权利要求1所述利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s2中，其他营养物质为产油酵母生长繁殖所需的必须营养成分，如磷酸二氢钾，七水硫酸镁。

6.如权利要求1所述利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s3中，产酶酵母种子液按照接种量2％～10％(v/v)接入培养基中进行发酵，这里v/v为体积比。发酵ph范围为5.5-6.5，温度范围为25-32℃。

7.如权利要求1所述利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s3中，苯甲酰胺可以被产油酵母彻底代谢。

8.如权利要求1所述，利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s3中，该酵母能够积累大量油脂，油脂得率在0.2-0.25g/g之间。

9.如权利要求1所述，利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s3中，当较高浓度的甲酰胺作为主要氮源，整个发酵过程可以在非灭菌条件下进行，且不会污染杂菌。

10.如权利要求1所述利用甲酰胺作为氮源进行非灭菌发酵的方法，其特征在于，步骤s4中，抽提所获油脂为一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂，适合作为生物柴油的原料。

技术总结本发明适用于产油微生物培养技术领域，提供一种基于特殊氮源甲酰胺的非灭菌油脂发酵方法。具体地，毛孢子油脂酵母能够耐受较高浓度的甲酰胺，并代谢甲酰胺中的氮，以此驱动其迅速增殖并高效累积油脂。由于甲酰胺自身具备抗菌特性，因此整个发酵流程可以在开放的环境中进行，这一特点极大地简化了操作步骤并降低了生产成本。甲酰胺代谢产物的中间产物甲酸，本可以作为碳源被代谢，进一步实现了原料的全物质循环利用，提升了资源利用效率，降低了环境负担。本发明不仅提升了生产效率和降低了操作成本，还为环境保护和资源再利用提供了新的视角，展示了极高的实用价值和市场潜力。技术研发人员：李凌凌,何梦琪,龚志伟受保护的技术使用者：武汉科技大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14