一种促转移衍生物清除系统及其应用

本发明属于医药，涉及一种促转移衍生物清除系统及其应用。

背景技术：

1、约90％的癌症相关死亡是由癌症转移造成的，并且治疗效果不佳。血行转移是最主要的转移方式。循环肿瘤细胞从原发肿瘤脱落进入外周血循环，逃避免疫系统的识别，并浸润到远处器官形成转移。肿瘤患者外周血中循环肿瘤细胞的数量与癌症的转移和复发密切相关。值得注意的是，越来越多的证据表明，肿瘤外泌体(一种由肿瘤细胞分泌的细胞外小囊泡，大小为30-150nm)也是启动肿瘤转移的元凶。肿瘤外泌体作为信使，被原发肿瘤送入血液循环，并到达特定的远端器官，甚至在循环肿瘤细胞到达之前就为其定植准备了转移前生态位。“种子土壤”假说描述了循环肿瘤细胞(种子)在转移前生态位(土壤)中定植以促进肿瘤的转移。肿瘤外泌体就像肥料一样，使土壤(转移前生态位)变得肥沃，有利于种子(循环肿瘤细胞)的生长。早期的研究表明，循环肿瘤细胞和肿瘤外泌体具有亲器官性，可以通过血液循环到达特定的远端器官并形成转移。不幸的是，接受过传统抗肿瘤治疗的肿瘤患者，如手术切除、放疗、化疗等，由于血液中循环肿瘤细胞和肿瘤外泌体的增加，仍有很大的肿瘤转移和复发的风险。

2、到目前为止，还没有成熟的技术可以同时阻止循环肿瘤细胞和肿瘤外泌体通过血液循环分布到远端器官。除此之外，血液中还有很多其他促转移衍生物，比如促转移的细胞因子、循环肿瘤dna、促转移的肿瘤相关细胞。因此，迫切需要提出能够高效清除促转移衍生物的系统，用于阻止循环肿瘤细胞和肿瘤外泌体等促转移衍生物到达远端器官，抑制肿瘤转移和复发。

3、此外，循环肿瘤细胞、肿瘤外泌体与原发肿瘤组织在基因组突变、基因表达、蛋白表达等方面有很大的相似之处，可作为无创诊断的液体活检标志物。然而，目前的检测技术在用于体外分析的典型血量(5-10ml)只占全身血液的千分之一，存在采样偏差，导致假阴性结果。因此，需要开发一种能够大规模处理全身外周血，并且高效富集促转移衍生物的系统，用于收集具有代表性的肿瘤样本，以便下游分析。

技术实现思路

1、发明目的：本发明目的在于提供一种促转移衍生物清除系统，能够将患者的血液引出体外循环装置，清除血液中的促转移衍生物，比如循环肿瘤细胞、肿瘤外泌体等，然后将净化的血液输送回人体血液循环，显著抑制促转移衍生物分布到远端器官，有效减小肿瘤远端转移概率，降低对患者的伤害，提高患者治愈率。同时，能够从免疫吸附剂上释放并收集肿瘤样本，比如循环肿瘤细胞、肿瘤外泌体，对患者的诊断及治疗均具有指导性意义。

2、技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、本发明提供了一种促转移衍生物清除系统，包括一个或多个捕获柱、静脉导管、留置针和蠕动泵；所述清除系统以留置针、静脉导管、捕获柱、蠕动泵、静脉导管、留置针的顺序依次连接；

4、所述捕获柱内填充清除促转移衍生物的免疫吸附剂；

5、所述促转移衍生物清除系统使流经捕获柱血液中的促转移衍生物被特异性吸附在免疫吸附剂表面或者内部，再将净化后的血液输回体内。

6、所述免疫吸附剂的表面或者内部嵌合特异性结合促转移衍生物的配体。

7、所述配体为肿瘤特异性的抗体、多肽、核酸适配体或小分子中的一种或几种；优选抗上皮细胞粘附蛋白(epcam)、细胞角蛋白(cytokeratin，ck)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)、表皮生长因子受体1(epidermal growthfactor receptor，egfr)、原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermal growthfactor receptor-2,her2)抗体中的两种或两种以上。

8、所述小分子为透明质酸或凝集素。

9、所述免疫吸附剂的载体材质为琼脂糖、聚苯乙烯-二乙烯苯树脂、聚乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、纤维素、甲壳素或碳纳米管中的一种或几种，优选为琼脂糖。

10、所述免疫吸附剂按照以下方法制备：以琼脂糖凝胶微球为载体，使用环氧氯丙烷环氧化琼脂糖凝胶微球，在碳酸盐缓冲液中，利用抗体等配体分子的氨基或者巯基与环氧基团发生开环反应，实现配体偶联，制得所述免疫吸附剂。

11、所述免疫吸附剂为球形结构，平均粒径为10-1000μm，且为多孔结构，孔径分布范围10nm-200nm。

12、所述免疫吸附剂的作用原理为：允许大尺寸促转移衍生物被特异性吸附在表面，比如循环肿瘤细胞；小尺寸促转移衍生物既可以被特异性吸附在表面，也可以通过分子筛和特异性吸附双重作用吸附在内部，比如肿瘤外泌体、促转移的细胞因子。

13、所述促转移衍生物包括循环肿瘤细胞、肿瘤外泌体、促转移的细胞因子(包括但不限于血管内皮生长因子、转化生长因子-β、白介素4、白介素10)、循环肿瘤dna、促转移的肿瘤相关细胞(包括但不限于肿瘤相关成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞)。

14、所述促转移衍生物主要指循环肿瘤细胞和肿瘤外泌体。

15、本发明的促转移衍生物清除系统使用0.25％的胰蛋白酶-edtau洗脱被特异性结合的循环肿瘤细胞；使用ph 2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱被特异性结合的肿瘤外泌体，收集用于下游分析。

16、本发明还提供了所述促转移衍生物清除系统的应用：一种促转移衍生物灌流系统。本发明一种促转移衍生物灌流系统包括动脉压力表、血液泵、肝素泵、流入压力表、除气系统、静脉压力表，还包括所述的促转移衍生物清除系统；所述动脉压力表、血液泵、肝素泵、流入压力表、促转移衍生物清除系统、除气系统、静脉压力表通过体外血液管道依次连接；

17、所述血液泵提供体外血液循环的动力；所述肝素泵向血液提供肝素，防止发生凝血；所述促转移衍生物清除系统用于清除促转移衍生物，比如循环肿瘤细胞、肿瘤外泌体等；净化的血液经过所述除气系统排除气泡后，在静脉压力表检测血液合格后，输送到患者体内。

18、有益效果：

19、本发明提供的促转移衍生物清除系统将免疫吸附剂填充到捕获柱，患者血液流经捕获柱，血液中促转移衍生物被特异性吸附到吸附剂表面或者内部；不仅有效清除血液中促转移衍生物，包括循环肿瘤细胞、肿瘤外泌体等，抑制它们分布到远端器官，减少肿瘤转移的概率；同时，能够从免疫吸附剂上释放并收集肿瘤样本，比如循环肿瘤细胞、肿瘤外泌体，对患者的诊断及治疗均具有指导性意义。

技术特征：

1.一种促转移衍生物清除系统，其特征在于，包括一个或多个捕获柱、静脉导管、留置针和蠕动泵；所述清除系统以留置针、静脉导管、捕获柱、蠕动泵、静脉导管、留置针的顺序依次连接；

2.根据权利要求1所述的促转移衍生物清除系统，其特征在于，所述免疫吸附剂的表面或者内部嵌合特异性结合促转移衍生物的配体。

3.根据权利要求2所述的促转移衍生物清除系统，其特征在于，所述配体为肿瘤特异性的抗体、多肽、核酸适配体或小分子中的一种或几种；所述小分子为透明质酸或凝集素。

4.根据权利要求2所述的促转移衍生物清除系统，其特征在于，所述免疫吸附剂的载体材质为琼脂糖、聚苯乙烯-二乙烯苯树脂、聚乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚丙烯酸酯、纤维素、甲壳素或碳纳米管中的一种或几种，优选为琼脂糖。

5.根据权利要求4所述的促转移衍生物清除系统，其特征在于，所述免疫吸附剂按照以下方法制备：以琼脂糖凝胶微球为载体，使用环氧氯丙烷环氧化琼脂糖凝胶微球，在碳酸盐缓冲液中，利用配体分子的氨基或者巯基与环氧基团发生开环反应，实现偶联，制得所述免疫吸附剂。

6.根据权利要求1所述的促转移衍生物清除系统，其特征在于，所述免疫吸附剂为球形结构，平均粒径为10-1000μm，且为多孔结构，孔径分布范围10nm-200nm。

7.根据权利要求1所述的促转移衍生物清除系统，其特征在于，所述免疫吸附剂允许大尺寸促转移衍生物被特异性吸附在表面；小尺寸促转移衍生物既可以被特异性吸附在表面，也可以通过分子筛和特异性吸附双重作用吸附在内部。

8.根据权利要求1所述的促转移衍生物清除系统，其特征在于，所述促转移衍生物包括循环肿瘤细胞、肿瘤外泌体、促转移的细胞因子、循环肿瘤dna、促转移的肿瘤相关细胞。

9.根据权利要求8所述的促转移衍生物清除系统，其特征在于，使用0.25％的胰蛋白酶-edta洗脱被特异性结合的循环肿瘤细胞；使用ph 2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱被特异性结合的肿瘤外泌体，收集用于下游分析。

10.一种促转移衍生物灌流系统，包括动脉压力表、血液泵、肝素泵、流入压力表、除气系统、静脉压力表，其特征在于，还包括权利要求1-9任一项所述的促转移衍生物清除系统；所述动脉压力表、血液泵、肝素泵、流入压力表、促转移衍生物清除系统、除气系统、静脉压力表通过体外血液管道依次连接；

技术总结本发明公开了一种促转移衍生物清除系统，包括一个或多个捕获柱、静脉导管、留置针和蠕动泵；所述清除系统以留置针、静脉导管、捕获柱、蠕动泵、静脉导管、留置针的顺序依次连接；所述捕获柱内填充免疫吸附剂。本发明清除系统通过建立体外循环支路将外周血引出体外，流经填充有免疫吸附剂的捕获柱，循环肿瘤细胞(CTCs)和肿瘤外泌体(TDEs)等促转移衍生物与免疫吸附剂特异性结合而被滞留在捕获柱内，实现全身高效清除促转移衍生物，抑制其在远端器官的分布，减少肿瘤转移的几率；同时，被捕获的循环肿瘤细胞和肿瘤外泌体等促转移衍生物被洗脱收集，为肿瘤诊断、检测提供代表性的样本。技术研发人员：姜虎林,孙应,罗俊,邢磊,周天娇,王译受保护的技术使用者：中国药科大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14