一种注射用丝蛋白复合羟基磷灰石微球填充剂及其制备方法与流程

本发明属于医疗美容整形,具体地说,涉及不同分子量的丝蛋白复合羟基磷灰石微球注射填充剂制备方法。

背景技术：

1、近年来，用于医美填充剂的可注射凝胶迅速发展，通过提高透明质酸的交联度可以延长注射剂的降解时间、增加其弹性模量，适用于不同的填充部位，如泪沟、鱼尾纹等需要浅表填充的部位，太阳穴、鼻子、下巴等需要中等深度填充的部位，以及鼻唇沟、口角衔接、额颞部等需要深度填充的部位。专利cn116284886a建立多重交联的凝胶体系以增加稳定性和粘弹度，但是交联剂的加入会增加注射剂的毒性，引发局部组织反应，因此迫切需要一种生物安全性更高的材料去满足不同求美需求。

2、丝蛋白作为一种理想的天然高分子材料，具有免疫原性极低，生物相容性良好等优点，且具有促进胶原蛋白再生的优势，常被用于组织工程，软组织修复，创伤修复等领域。不同分子量的丝蛋白，其弹性模量和复合粘度不同，降解周期不同，适用的填充部位和深度不同，但是丝蛋白凝胶作为填充剂也有需要克服的难题：1.难以精准测定不同分子量的丝蛋白；2.丝蛋白凝胶化速度缓慢，导致丝蛋白凝胶的初始污染菌极易超标，因此需要让其快速凝胶化以适应规模化生产。

3、羟基磷灰石作为人体和动物骨骼的主要无机成分，其代谢物是人体内常见的钙离子和磷酸盐离子，具有良好的生物相容性，将羟基磷灰石微球与丝蛋白-纤维素凝胶混合，有利于实现持续胶原原位再生。专利cn116808290a通过将凝胶和微球混合后的填充剂干粉化，延长其保质期，但是难以使微球在复溶后的凝胶基质中分散均匀，而且使用不方便，步骤比较繁琐，在手术实施过程中增加了医生的难度；专利cn117919515a通过双正态分布微球与凝胶基质混合，使其具有良好的注射性和形状可塑性，但是其中小粒径的微球（1~10微米）容易引发巨噬细胞风暴，产生肉芽肿的风险，需要更安全的方式使羟基磷灰石微球和凝胶基质混合均匀。

技术实现思路

1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了不同分子量且分子量分布较窄的丝蛋白复合羟基磷灰石微球填充剂制备方法，为了保证填充剂安全性的同时满足多种求美需求，适用于多种填充部位，本发明提出通过ai算法结合丝蛋白的流变学特性筛选出不同分子量的丝蛋白，其弹性模量和复合粘度不同，降解周期不同，适用于不同的填充部位和深度； 通过混合和加热的简单方法开发出一种新型的丝蛋白复合羟基磷灰石微球填充剂，加热后羟基纤维素或者羧基纤维素，比如羟基丙基甲基纤维素或羟丙基纤维素或羧甲基纤维素、羟乙基纤维素与丝蛋白分子之间的疏水相互作用诱导丝蛋白分子链从无规卷曲到β-折叠，这种二次结构转变使丝蛋白内部可以形成小而均匀的β-折叠结构，而正是其作为交联位点均匀分布在整个水凝胶，这种简单有效的方式避免了化学交联剂的使用，提高了填充剂的安全性；通过层层自组装方式在羟基磷灰石微球表面包裹丝蛋白和纤维素，增加其表面亲水性，再将羟基磷灰石微球与丝素-维素凝胶负压搅拌脱泡，制备出的注射凝胶力学性能优异，微球分散性良好，易于挤出。

2、为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明提出了注射用丝蛋白复合羟基磷灰石微球填充剂制备方法，所述混合凝胶包括如下组分：丝蛋白-纤维素凝胶、修饰的羟基磷灰石微球、渗透压调节剂、注射用水。

3、优选地，所述丝蛋白-纤维素凝胶包括丝蛋白-羟丙基甲基纤维素和丝蛋白-羧甲基纤维素。

4、优选地，所述丝蛋白-纤维素凝胶的制备方法具体包括以下步骤：

5、s1：丝蛋白溶液的制备：脱胶丝经过溶解、纯化制备得到丝蛋白，通过不同截留分子量的膜筛选出不同分子量的丝蛋白；

6、s2：丝蛋白物理凝胶化：将物理交联剂溶于水中充分溶胀，在步骤s1中制备的丝蛋白水溶液中加入羟基纤维素或羧基纤维素或相应的衍生物水溶液，调节渗透压，再将混合溶液搅拌均匀，置于烘箱凝胶化；

7、s3：层层自组装修饰的羟基磷灰石微球制备：将羟基磷灰石微球分散于步骤s1中制备的丝蛋白溶液里，室温下搅拌，然后取出微球干燥；再将其溶解于纤维素溶液里，室温下搅拌，然后取出微球干燥；反复3~5次；

8、s4:注射用丝蛋白复合羟基磷灰石微球填充剂的制备:将修饰后的羟基磷灰石微球与丝蛋白-纤维素凝胶负压搅拌脱泡，再将其高压蒸汽灭菌，无菌灌装在预灌封注射器中,得到注射用丝蛋白复合羟基磷灰石微球填充剂；

9、进一步的，

10、s1：不同分子量丝蛋白的制备及测定：桑蚕蚕丝经过脱胶、溶解、纯化脱盐步骤制备得到丝蛋白，将丝蛋白溶解于离子液体中，置于mcr301旋转流变仪上进行测试，分别测定多个测试温度下的数据曲线，然后将数据用rouse模型进行建模，同时测定模型所需的物理参数，再通过ai算法进行非线性模型拟合，得到分子量数据，由拟合参数计算丝蛋白的分子量大小。

11、其中，参照正在公示的行业标准《组织工程医疗器械 丝蛋白》附录b，测得流变学数据以及黏度数据等导入favorsun smartmolfit“复向智算”生物大分子分子量计算商用软件。

12、测试方法具体为：

13、a.1测试步骤

14、a.1.1黏度测试

15、选择合适直径（使数据不超过流变仪的测试范围，且能获得稳定信号），如25 mm的平行板（parallel plate，pp25）。测试过程中通过控温罩（h-ptd200 hood with peltierheating/cooling）的氮气吹扫对测试进行保护；此外，在样品与平行板边缘滴加很薄的一层低黏度硅油（黏度约为10 mpa·s）,以防止测试过程中样品对水汽的吸收。

16、采取稳态测试模式：实验温度为30 ℃，剪切速率由低到高进行扫描，剪切速率范围为：10-3 s-1~103 s-1。记录平台曲线的黏度数值。

17、a.1.2储能模量及损耗模量测试

18、样品放置和测试准备同b.4.1

19、采用线性动态弹性测试模式，即震荡模式的应变振幅控制在10 %以下，以确保在频率扫描范围（1×102 rad/s～6.81×10-2 rad/s）内存储模量（）和损耗模量（）为线性。测试在30 %～40 %的相对湿度下进行。

20、在以下几个温度下（0 ℃、10 ℃、20 ℃和30 ℃）进行频率扫描，得到不同温度下样品的储能模量和损耗模量曲线，每次测试时间保证在1.5 h以内。

21、a.2计算

22、b.5.1 体系成立的确认

23、采用amimcl溶剂体系时，文献[1]验证实验研究表明体系的huggins参数kh约为0.1，可判断该溶剂为丝蛋白的良溶剂。具体按式（1）～（3）计算。

24、a)通过测量同一温度下溶液和溶剂在不同浓度下的黏度，按式（1）计算比黏度。

25、…………(1)

26、式中，

27、——黏度；

28、 ——溶液的黏度；

29、 ——溶剂的黏度；

30、b)根据浓度逼近时的极限值，按式（2）计算特性黏数的值。

31、…………(2)

32、式中，

33、[η] ——特性黏数；

34、 ——比黏度；

35、c ——溶液的质量浓度。

36、c)由溶液的黏度按式(3)计算huggins参数：

37、…………(3)

38、式中，

39、 ——比黏度；

40、c ——溶液的质量浓度；

41、[] ——特性黏数；

42、a ——溶剂的黏度；

43、kh ——huggins参数。

44、注1：本文件验证实验证实采用amimcl溶剂体系的huggins参数约为0.1，符合要求，可不做验证；

45、注2：若采用其他溶剂体系，则需要进行验证。

46、b.5.2 分子量拟合计算

47、将所测得流变学数据以及黏度数据等导入favorsun smartmolfit“复向智算”生物大分子分子量计算商用软件，计算数均分子量和重均分子量。或者按式（4）～（10）计算。

48、a）储能模量和损耗模量：仪器参数设置中，应变 ，应力，为角频率，为应力超前相角。将应力展开为。应力—应变关系可以进一步用一个和应变同相位的储能模量（）和一个与应变相位差为耗能模量（）表示，如式（4）～式（6）：

49、…………(4)

50、…………(5)

51、…………(6)

52、其中，储能模量，反映施加应变后在样品中储存的能量。损耗模量，反映响应过程中能量的损耗。在动态剪切法中，流变仪可以给出储能模量与损耗模量随交变剪切频率的关系。储能模量和损耗模量可以从仪器测试结果中直接获得。

53、b）位移因子的计算：利用测试步骤b.4.1中的不同温度下样品的黏度曲线来计算位移因子（），按式（7）计算：

54、式中，

55、 ——比黏度；

56、c ——溶液的质量浓度；

57、[] ——特性黏数；

58、a ——溶剂的黏度；

59、kh ——huggins参数。

60、注1：本文件验证实验证实采用amimcl溶剂体系的huggins参数约为0.1，符合要求，可不做验证；

61、注2：若采用其他溶剂体系，则需要进行验证。

62、b.5.2 分子量拟合计算

63、将所测得流变学数据以及黏度数据等导入favorsun smartmolfit“复向智算”生物大分子分子量计算商用软件，计算数均分子量和重均分子量。或者按式（4）～（10）计算。

64、a）储能模量和损耗模量：仪器参数设置中，应变 ，应力，为角频率，为应力超前相角。将应力展开为。应力—应变关系可以进一步用一个和应变同相位的储能模量（）和一个与应变相位差为耗能模量（）表示，如式（4）～式（6）：

65、…………(4)

66、…………(5)

67、…………(6)

68、其中，储能模量，反映施加应变后在样品中储存的能量。损耗模量，反映响应过程中能量的损耗。在动态剪切法中，流变仪可以给出储能模量与损耗模量随交变剪切频率的关系。储能模量和损耗模量可以从仪器测试结果中直接获得。

69、b）位移因子的计算：利用测试步骤b.4.1中的不同温度下样品的黏度曲线来计算位移因子（），按式（7）计算：

70、………………(7)

71、式中，

72、 ——位移因子；

73、——不同温度下样品的黏度，pa•s；

74、——30 ℃下样品的黏度，pa•s；

75、 ——不同测试温度，℃；

76、 ——30 ℃；

77、c）分子量分布曲线拟合：

78、假定溶液中分子量为10 kda到40 kda的丝蛋白分子的概率密度，代入rouse模型，按公式（8）～（10）得到拟合曲线：

79、

80、

81、

82、式中，

83、 ——储能模量；

84、 ——损耗模量

85、 ——溶液密度；

86、——气体常数（8.31）；

87、——测试时的绝对温度

88、mi——一个丝蛋白分子的分子量，这里取10 kda~40 kda

89、f(i)为分子量为mi的概率密度

90、0 ——高分子溶液的黏度；

91、 ——分子量m的高分子链的第p种松弛模式的松弛时间

92、d）分子量计算：利用式（7）得到的位移因子，将测试步骤b.4.2的测试结果进行平移，将低温下测试数据经平移获得高频区数据，获得主曲线；将主曲线与步骤b.5.2 c）得到的拟合曲线进行对比，不断迭代直至主曲线与拟合曲线达到最优重合，即“在优化过程中引入动态收敛因子，通过自适应权重策略，提高优化算法的全局寻优能力。随着迭代次数的递增，动态收敛因子的数值逐渐减小到0，当当前迭代次数达到最大迭代次数时，收敛过程终止，即为最优重合”。此假定值即为溶液中分子量为10 kda到40 kda的丝蛋白的真实概率密度。再由此概率密度进行进一步计算，可得到丝蛋白的数均分子量、重均分子量以及分子量分布指数。计算公式为：

93、

94、

95、上述过程也可以参见wo2023/024607中对分子量测试以及ai计算的描述。

96、s2：丝蛋白-纤维素凝胶的制备：将纤维素溶于水中充分溶胀，在步骤s1中制备的丝蛋白水溶液中加入纤维素水溶液，混合后冰浴超声处理，再用渗透压调节剂调节渗透压至250~350mosm/l，再将混合溶液搅拌均匀，置于烘箱凝胶化。

97、优选地，在s1中，所述丝蛋白的分子量为10~200 kd。

98、优选地，在s2中，所述丝蛋白和纤维素的质量比为1:1-10：1。

99、优选地，在s2中，所述丝蛋白的质量分数为0.5~5%。

100、优选地，在s2中，所述纤维素的质量分数为0.05~5%。

101、优选地，在s2中，纤维素溶胀时间为6~26h。

102、优选地，在s2中，超声处理的条件为超声功率为200~500w，冰浴温度为4~10℃，超声时间为0.1~1h。

103、优选地，在s2中，所述渗透压调节剂为0.9 wt%的氯化钠溶液或磷酸盐缓冲溶液（pbs）。

104、优选地，在s2中，烘箱温度为70~80℃，凝胶化时间为8~24h。

105、本发明还提供一种注射用含羟基磷灰石微球的丝蛋白填充剂的制备方法，具体包括以下步骤：

106、s3：将羟基磷灰石微球分散于2wt%丝蛋白溶液里，室温下以200rpm搅拌，然后取出微球干燥，再将其分散于0.5wt%纤维素溶液里，室温下以200rpm搅拌，然后取出微球干燥，反复几次；

107、优选地，在s3中，羟基磷灰石微球的粒径为20~45微米。

108、经过s3处理后，微球表面覆盖一层高分子复合膜，表面微孔消失，相当于层层自组装。

109、s4：将修饰后微球与丝蛋白-纤维素凝胶负压搅拌脱泡，再将其高压蒸汽灭菌,灌装在预灌封注射器中,得到注射用含羟基磷灰石微球的丝蛋白混合凝胶。

110、优选地，在s4中，羟基磷灰石微球的质量和丝蛋白溶液的体积比为1~20g：100 ml。

111、优选地，在s4中，羟基磷灰石微球的质量和纤维素溶液的体积比为1~20g：100 ml。

112、优选地，在s4中，羟基磷灰石微球和丝蛋白-纤维素凝胶的质量比为1：10~1：1。

113、优选地，在s4中，羟基磷灰石微球和丝蛋白-纤维素凝胶搅拌条件为2~10 千帕，500~2500转/分钟，0.1~2小时。

114、优选地，在s4中，高压蒸汽灭菌的温度为115~125℃，时间为15~30分钟。

115、所述羟基纤维素或羧基纤维素选自羟基丙基纤维素、或羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素的一种或多种。

116、一种注射用丝蛋白复合羟基磷灰石微球填充剂，采用上述制备方法得到。

117、上述注射用丝蛋白复合羟基磷灰石微球填充剂的用途，用于医美填充剂，比如用于面部或者用于泪沟、鱼尾纹、太阳穴、鼻子、下巴、鼻唇沟、口角衔接、额颞部的一种或多种。

118、本发明取得的有益效果如下：

119、本发明提供不同分子量的丝蛋白复合羟基磷灰石填充剂制备方法，通过加热后羟丙基甲基纤维素分子或羧甲基纤维素或羟乙基纤维素与丝蛋白分子之间的疏水相互作用诱导丝蛋白分子链从无规卷曲到β-折叠，这种二次结构转变可以使丝蛋白内部形成小而均匀的β-折叠结构，而正是其作为交联位点均匀分布在整个凝胶体系，形成三维纤维网络结构，从而避免了添加化学交联剂而导致的皮肤过敏问题；通过层层自组装方式让羟基磷灰石微球表面先覆盖一层丝素-纤维素薄膜，增加微球表面亲水性，再与丝蛋白-纤维素凝胶搅拌均匀，能够使羟基磷灰石微球在凝胶体系里分散均匀，避免了填充剂因为微球抱团而导致的面部红肿、结节等问题；通过ai算法结合丝蛋白的流变学特性测定丝蛋白的分子量，利用不同分子量的丝蛋白具有不同程度的弹性模量和复合粘度，将丝蛋白混合凝胶作用于不同的填充部位和层次，以满足不同求美需求；以上所添加的各种成分均具有良好的生物相容性，能够降低填充物在体内的排异性，避免填充后出现的过敏、红肿的皮肤问题。