一种人Vγ9Vδ2T细胞扩增培养基及其扩增培养方法与流程

本发明属于细胞培养，特别是涉及一种人vγ9vδ2t细胞扩增培养基及其扩增培养方法。

背景技术：

1、肿瘤过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞(具有特异免疫力)或其产物输给细胞免疫功能低下者(如肿瘤病人)，使其获得抗肿瘤免疫力，它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法。1985年美国国家癌症研究委员会将癌症的免疫疗法确立为继外科手术、放射疗法和化学药物疗法之后的第四种疗法。

2、根据t细胞表面tcr的类型，可将t细胞分为αβt细胞和γδt细胞两类。其中αβt细胞即通常所称的t细胞，其表面表达tcrαβ，占t细胞总数的95％以上；而γδt细胞表面表达tcrγδ。γδt细胞是1986年被发现的，在疾病初始阶段具有快速、直接反应的能力，在天然免疫反应中扮演重要角色。γδt细胞是一类不同于αβt细胞的主要t细胞亚群，是人体内联系固有免疫和适应性免疫之间的桥梁，参与多种免疫应答过程，在肿瘤免疫、感染免疫、自身免疫功能调节等方面具有重要价值。γδt细胞对肿瘤细胞具有直接细胞毒性，能通过直接杀伤作用和释放细胞因子来共同控制肿瘤细胞的生长和转移，其杀伤作用不依赖于mhc分子。在nature medicine文献报道，对9020例各类肿瘤患者的大数据分析表明，瘤内γδt细胞的浸润是所有肿瘤预后的最好标志。因此，越来越多的研究人员关注γδt的抗肿瘤作用。

3、人γδt细胞根据其表面δ链可分为vδ1、vδ2和vδ3t细胞。通常情况下，外周血中50％～75％的γδt淋巴细胞表达vδ2链，共表达vγ9链。这些细胞被命名为人vγ9vδ2t细胞。由于人vγ9vδ2t细胞在外周血γδt细胞中占比较多，能够识别磷酸化抗原，具有较强的抗肿瘤能力，因此多数的γδt细胞临床研究集中在人vγ9vδ2t细胞上。由于γδt细胞在外周血中占比少，因此现有的扩增方式均存在体外扩增倍数低的问题，扩增细胞数量达不到临床使用的量。目前常用的扩增方式为使用tcrγδ抗体激活或使用氨基磷酸盐进行激活，并且辅以il-2等细胞因子进行扩增。但是用tcrγδ抗体扩增出的γδt细胞含有vδ1和vδ2两个亚群，且用抗体扩增的成本高，扩增数量少，无法实现大规模扩增，因此无法满足临床需求。而另一种现有的扩增路线，使用氨基磷酸盐如唑来膦酸进行扩增，则会导致ros的累积，扩增出的细胞存活时间较短，细胞抗凋亡能力不强，分泌细胞因子能力弱，对肿瘤杀伤能力不强等问题。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是克服上述已有技术的不足，提供一种抗凋亡能力、对肿瘤杀伤能力显著增强的人vγ9vδ2t细胞扩增培养方法、其培养基，并且该培养方法为无血清大规模培养方案，可以满足后续临床需求。

2、为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

3、一种人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，包括optmizer无血清培养基，还包括白介素-2和白介素-15以及n-乙酰半胱氨酸。

4、优选地，上述白介素-2的浓度为100-1000u/ml，白介素-15的浓度为1-100ng/ml，n-乙酰半胱氨酸的浓度为100μm-10mm。

5、优选地，上述人vγ9vδ2t细胞扩增培养基中加入氨基磷酸类化合物得到相应的人vγ9vδ2t细胞激活培养基。

6、优选地，上述人vγ9vδ2t细胞激活培养基中，氨基磷酸类化合物包括唑来膦酸、帕米膦酸、二磷酸溴丙烷、异戊烯焦磷酸中的一种或多种；氨基磷酸类化合物的浓度为1-100μm。

7、一种基于上述人vγ9vδ2t细胞扩增培养基的培养方法，包括以下步骤：

8、步骤1、对外周血单个核细胞进行激活培养，得到激活后的细胞悬液；

9、步骤2、使用人vγ9vδ2t细胞扩增培养基稀释激活后的细胞悬液，继续培养72小时；

10、步骤3、添加人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，继续培养72小时；

11、步骤4、将所得培养液转移培养容器，添加人vγ9vδ2t细胞扩增培养基；

12、步骤5、继续培养72小时；

13、步骤6、收集细胞。

14、优选地，步骤1中的激活培养，包括将外周血单个核细胞重悬于人vγ9vδ2t细胞激活培养基中，静置培养72小时。

15、优选地，步骤1中所得细胞悬液，细胞浓度为1-2*106个/ml。

16、优选地，步骤2中的稀释，稀释至细胞浓度0.5-1*106个/ml。

17、优选地，步骤2-3中的培养在t175培养瓶中进行，在步骤2-3进行过程中，每隔48-72小时用人vγ9vδ2t细胞扩增培养基对细胞培养液进行加液，加液量为补充至瓶容积标准的2/3。

18、优选地，步骤4中转移培养容器，包括将培养液从t175培养瓶中转入1.8l的细胞培养袋中，步骤4添加人vγ9vδ2t细胞扩增培养基至1000ml。

19、优选地，上述步骤3包括：添加人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，并添加紫杉醇，继续培养72小时；

20、优选地，上述步骤4包括：将所得培养液转移培养容器，添加人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，并添加tgf-β。

21、优选地，步骤3中添加各组分的终浓度分别为n-乙酰半胱氨酸至终浓度15-19mm，紫杉醇至终浓度0.5-1μm。

22、优选地，步骤4中添加各组分的终浓度分别为n-乙酰半胱氨酸至终浓度18-20mm，tgf-β至终浓度4-7nm。

23、本发明的有益效果：

24、本发明的目的首先在于提供一种人vγ9vδ2t细胞扩增培养方法，能够提高人vγ9vδ2t细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人vγ9vδ2t细胞具有较强的肿瘤杀伤能力及抑制能力，细胞本身的存活时间更长，抗凋亡能力更强。该方法基于一种人vγ9vδ2t细胞无血清扩增培养基开发，能够从外周血单个核细胞中选择性的扩增出人vγ9vδ2t细胞，且与传统的rpmi+10％胎牛血清培养方法相比，所扩增得到的人vγ9vδ2t细胞的纯度高。并且本发明提供的扩增方法为大规模扩增的方法，培养体积可达2l，极大地提高了人vγ9vδ2t细胞的扩增数量，从而为人vγ9vδ2t细胞临床使用，提供了坚实的基础。

25、具体地，人vγ9vδ2t细胞增殖培养基中n-乙酰半胱氨酸的加入有效避免细胞凋亡；在制备方法中加入的紫杉醇、tgf-β能够显著提高最终的扩增倍数以及在一定程度上提高细胞纯度的作用。

技术特征：

1.一种人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，其特征在于：包括optmizer无血清培养基，还包括白介素-2和白介素-15以及n-乙酰半胱氨酸。

2.根据权利要求1所述的人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，其特征在于：所述白介素-2的浓度为100-1000u/ml，白介素-15的浓度为1-100ng/ml，n-乙酰半胱氨酸的浓度为100μm-10mm。

3.根据权利要求1所述的人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，其特征在于：所述人vγ9vδ2t细胞扩增培养基中加入氨基磷酸类化合物得到相应的人vγ9vδ2t细胞激活培养基。

4.根据权利要求3所述的人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，其特征在于：所述人vγ9vδ2t细胞激活培养基中，氨基磷酸类化合物包括唑来膦酸、帕米膦酸、二磷酸溴丙烷、异戊烯焦磷酸中的一种或多种；氨基磷酸类化合物的浓度为1-100μm。

5.一种基于权利要求1-4任一项所述的人vγ9vδ2t细胞扩增培养基的人vγ9vδ2t细胞扩增培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的人vγ9vδ2t细胞扩增培养方法，其特征在于：步骤1所述激活培养，包括将外周血单个核细胞重悬于人vγ9vδ2t细胞激活培养基中，静置培养72小时。

7.根据权利要求5所述的人vγ9vδ2t细胞扩增培养方法，其特征在于：步骤4所述转移培养容器，包括将所得培养液从t175培养瓶中转入1.8l的细胞培养袋中，步骤4添加人vγ9vδ2t细胞扩增培养基至1000ml。

8.根据权利要求5所述的人vγ9vδ2t细胞扩增培养方法，其特征在于：所述步骤3包括：添加人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，并添加紫杉醇，继续培养72小时。

9.根据权利要求5所述的人vγ9vδ2t细胞扩增培养方法，其特征在于：所述步骤4包括：将所得培养液转移培养容器，添加人vγ9vδ2t细胞扩增培养基，并添加tgf-β。

技术总结本发明公开了一种人Vγ9Vδ2T细胞扩增培养基及其培养方法，属于细胞培养技术领域，培养基包括opTmizer无血清培养基，还包括白介素‑2和白介素‑15以及N‑乙酰半胱氨酸。基于该培养基扩增人Vγ9Vδ2T细胞，能够显著降低细胞扩增中产生的ROS，提高人Vγ9Vδ2T细胞的增殖效率与细胞纯度，培养得到的人Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤的杀伤及抑制能力更强，细胞抗凋亡能力更强。并且培养方法适用于大规模扩增，从而为人Vγ9Vδ2T细胞临床使用，提供了坚实的基础。技术研发人员：王盛洲,何学松,王翠敏,朱芳芳,王京苏,胡聪受保护的技术使用者：珠海善行免疫微生态产业研究院有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/14