一种CRISPR/Cas9介导的完整全长蜘蛛丝及其制备方法和应用与流程

本发明属于天然纤维领域，特别涉及一种crispr/cas9介导的完整全长蜘蛛丝及其制备方法和应用。

背景技术：

1、受自然界启发的生物模仿学为先进材料和工具的高效开发提供了契机。天然聚酰胺纤维，如家蚕丝和蜘蛛丝，尤其是蜘蛛丝，长期以来一直是材料科学家的灵感源泉。实际上，jeffrey l.yarger指出，尼龙本身就受到丝绸纤维的启发，两者都是聚酰胺纤维。蜘蛛丝的拉伸强度超过尼龙，韧性优于凯夫拉。因此兼具低密度、高强度和超韧性的蜘蛛丝在军工、航空航天、国防等其他对材料强度和韧性要求极高的领域中具有巨大的潜在应用价值。而且，蜘蛛丝还具有良好的生物相容性，因此也被研究用于生物医学领域，例如作为人工血管支架或生物可降解缝合线等。此外，家蚕丝和蜘蛛丝这两种既具有高强度又具有超韧性(与工程材料相反，韧性和强度往往是互相排斥的)的纤维，可以作为研究纤维韧性和强度本质的优秀研究材料。蚕丝和蜘蛛丝的力学性能由其四级结构决定，受到蛋白一级序列和纺丝过程的影响。在家蚕丝纤维中，甘氨酸(gly)和丙氨酸(ala)氨基酸占蛋白质组成的75％以上。在家蚕丝纤维中，重复序列(gly-ala-gly-x)n形成β折叠晶体区域。在蜘蛛丝中，β折叠晶体区域由ggx(x＝a、q或y)、gx(x＝q、a或r)和多丙氨酸序列形成。无论是源自家蚕还是蜘蛛的这些重复序列，在决定其强度和韧性方面起着关键作用，促进了β折叠晶体区域的形成。值得注意的是，尽管依赖于如氢键等弱非共价相互作用，这些β折叠晶体区域对于丝绸纤维的整体力学性能贡献巨大。此外，蚕丝和蜘蛛丝纤维符合可持续发展和环境友好性的原则，使其成为取代尼龙等合成商业纤维的优秀候选材料，从而促进生态文明的发展。然而，实现低成本、大规模生产出高力学性能的丝纤维对于其商业化至关重要。尽管蚕丝由于其低成本的生产而成为唯一一种大规模商业化生产的动物蛋白纤维，但目前蚕丝的应用主要限于纺织业，这是由其有限的机械性能所致。蜘蛛丝是包括商业合成纤维在内的机械性能最优异的丝纤维之一，但由于蜘蛛之间的相互捕食特性使得通过饲养实现大规模蜘蛛丝纤维生产变得困难，因此商业化仍然具有挑战性。然而，得益于基因工程的进展使得能够通过异源宿主表达蜘蛛丝蛋白并在体外人工纺出蜘蛛丝。然而，由于对蜘蛛丝成丝机理的理解尚不完整，以及对蜘蛛丝纤维的韧性和强度的本质尚未被破解，因此即使是目前最先进的微流体纺丝技术也无法复制天然蜘蛛丝纺丝所需的物理化学环境。因此，目前大部分的人造蜘蛛丝纤维在一个或多个方面的机械性能上仍不及其天然对应物。此外，由于在人造蜘蛛丝和再生丝素纤维中复制天然蚕丝和蜘蛛丝中的保护性“皮肤层”的固有挑战，人造蜘蛛丝和再生丝素纤维的机械性能维持时间明显较短。因此，解决上述的科学和工程挑战对于实现家蚕丝或蜘蛛丝作为尼龙等合成商业纤维的替代品以及促进生态文明的发展至关重要。

技术实现思路

1、本发明提供一种crispr/cas9介导的完整全长蜘蛛丝及其制备方法和应用，得到的完整全长蜘蛛丝解决了现有人造蜘蛛丝的机械性能不佳的技术问题。

2、本发明提供了一种crispr/cas9介导的完整全长蜘蛛丝，基于家蚕丝的最小基本单元结构模型，使得完整全长蜘蛛丝蛋白在家蚕丝腺体中表达；其中，所述最小基本单元结构模型为fib-h12fib-l12p252。

3、丝纤维的力学性能取决于丝蛋白的四级结构，其由蛋白一级序列和纺丝工艺所决定。本发明首次使用了完整全长蜘蛛丝蛋白一级序列替换了家蚕fib-h基因，并证明完整的一级序列的转基因蜘蛛丝具有更好的机械性能。同时，首次提出蚕丝的最小基本单元结构模型为fib-h12fib-l12p252，用于将完整全长蜘蛛丝蛋白在家蚕丝腺体内进行“本土化”，从而更好适应家蚕丝腺体纺丝机制。因此本发明针对所提出的蜘蛛丝纤维的力学性能由其蛋白的一级序列和纺丝工艺共同决定的理论，使用完整的全长蜘蛛丝和基于fib-h12fib-l12p252结构模型的在蚕丝腺体内的“本土化”而优化纺丝工艺。

4、本发明还提供了一种crispr/cas9介导的完整全长蜘蛛丝，基于crispr/cas9技术将家蚕丝素重链基因fib-h的中间重复区域替换为完整全长蜘蛛丝蛋白一级序列，并由获得的相应转基因蚕生产而得。

5、本发明得到的全长蜘蛛丝兼具超高拉伸强度(1299mpa)和超高韧性(319mj/m^3)，这是凯夫拉纤维韧性的六倍之多，是天然蚕丝韧性的5倍之多。首次证明了完整全长蜘蛛丝蛋白一级序列对转基因蚕生产的丝纤维的力学性能至关重要。

6、优选的，所述完整全长蜘蛛丝的来源包括小壶状腺丝(minor ampullate silk,misp)、大壶状腺丝(major ampullate silk)，鞭状腺丝(flagelliform silk)，聚状腺丝(aggregate silk)，葡萄状腺丝(aciniform silk)，管状腺丝(tubuliform silk)中的一种或几种。

7、优选的，所述完整全长蜘蛛丝包括完整一级序列的全长蜘蛛丝或其突变体、或任意其他氨基酸的替换和增添。

8、本发明还提供了一种crispr/cas9介导的完整全长蜘蛛丝的制备方法，包括如下步骤：

9、(1)设计用于敲除家蚕丝素重链基因fib-h的sgrna：

10、sgrna1，gatgcatctctaattatttc；sgrna2，tgtccgtatcccctgccagc；

11、(2)将sgrna引物分别退火并连接到使用bbsi限制性内切酶切割的sgrna质粒上；将pc131-n1-35s-yfp-misp质粒用bamhi和xhoi酶切，以获取完整的misp全长基因序列；然后使用同源重组酶将完整的misp连接到供体质粒上，得到转基因所需的misp供体质粒；然后通过显微注射技术将表达crispr/cas9蛋白和表达sgrna1，sgrna2以及misp供体质粒一起注射到新鲜的家蚕受精卵中，然后通过检测报告基因表达和基因测序筛选出转基因蚕；(3)将得到的转基因蚕根据传统工艺生产丝纤维，得到crispr/cas9介导的完整全长蜘蛛丝纤维。

12、优选的，所述步骤(2)中的引物为：

13、sgrna1-f，aaacgatgcatctctaattatttc；

14、sgrna1-r，aagtgaaataattagagatgcatc；

15、sgrna2-f，aaactgtccgtatcccctgccagc；

16、sgrna2-r，aagtgctggcaggggatacggaca。

17、本发明还提供了一种crispr/cas9介导的全长蜘蛛丝在生物医药领域、智能生物穿戴领域、纺织服装领域、军工领域、航空航天领域、医美等领域中的应用，例如在手术缝合线在中的应用。

18、本发明还提供了一种蛋白丝纤维，依据所述蚕丝最小基本单元结构模型基础上通过在转基因蚕丝腺体中“本土化”生产。

19、优选的，所述蛋白丝纤维包括蜘蛛丝、昆虫丝、海蛞蝓丝或其他任何天然蛋白丝纤维。

20、优选的，所述蛋白丝纤维中的蛋白包括非天然蛋白，以及天然蛋白或其中的部分序列。

21、本发明的完整全长蜘蛛丝证明了材料的强度的本质为分子间非共价键能密度(intermolecular non-covalent bond energy density,incbed)，韧性本质为平均单分子的分子间非共价键能密度(average single molecule intermolecular non-covalentbond energy density,asm-incbed)。根据上述理论可知，通过增加材料的incbed和asm-incbed则可以同时增加其韧性和强度。同时，本发明通过强制缫丝带来的剪切力增加了丝纤维的的incbed和asm-incbed，从而显著增加了其强度和韧性。

22、有益效果

23、(1)本发明通过生物信息学分析，引入了丝的最小结构单位的最新模型(fib-h12fib-l12p252)，旨在实现蜘蛛丝在家蚕中的本地化过程。通过应用crispr/cas9基因编辑技术，成功地实现了将fib-h的中间重复区域完全替换为了完整misp。通过获得首个能够生产本土化的完整全长蜘蛛丝的基因编辑家蚕，实现了重要的里程碑。

24、(2)本发明得到的完整全长蜘蛛丝兼具高拉伸强度和高韧性，不仅展示了蜘蛛丝替代尼龙等合成纤维的潜力，从而促进生态文明发展，还为各种结构领域高强度和超高韧性材料的开发提供了理论指导。最重要的是本发明涉及的转基因蚕有望实现超级蜘蛛丝的大规模低成本的商业化生产，可用于我国军工，航空航天，国防以及组织工程(如可降解显微手术缝合线)等领域，从而突破美国在此领域的垄断技术。