一种用于修复OTOF基因p.Q829X突变的单碱基编辑系统及其应用

本发明涉及分子生物学领域、医药领域，具体涉及一种用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统及其应用。

背景技术：

1、遗传性耳聋是一种常见的感觉障碍性疾病，据统计，每年约有0.2％的新生儿患有耳聋，其中约60％的患者是由遗传因素引起的。临床上治疗遗传性耳聋除了佩戴助听器或者人工耳蜗，尚无其他的有效的治疗药物。基因治疗策略如外源基因替换策略已经成功运用于耳聋恢复的研究，但这种替换策略并不适用于所有类型的疾病如显性遗传、显性负效应疾病等。

2、otof基因突变可引起一种常染色体隐性非综合征型听力损失dfnb9(omim601071)。otof基因编码otoferlin(耳畸蛋白)，它是一种膜钙结合蛋白，负责内毛细胞(inner hair cell，ihc)带状突触处突触囊泡的神经递质释放。otof基因的p.q829x突变(c.2485c>t)(氨基酸同源比对在小鼠中是c.2482c>t，p.q828x)是最常见的突变位点之一，约占西班牙常染色体隐性非综合症型听力损失患者的3～4.4％。携带纯合p.q829x基因突变的dfnb9患者表现为语前发病、双侧、对称性的重度或极重度感音神经性听力损失，这对他们的言语沟通能力造成了负面影响，并给日常生活带来了极大的困难。目前临床上还没有治疗这种听力损失的药物。

3、单碱基编辑技术是基于crispr/cas9开发而来的基因治疗工具，因可以在基因组中精准、高效地纠正突变受到广泛的关注。目前，单碱基编辑工具已经被批准应用治疗杂合子家族性高胆固醇血症，并在临床上能维持长期的治疗效果。然而，经查阅国内外相关资料，使用单碱基编辑系统治疗遗传性dfnb9耳聋的研究却鲜有报道，主要技术难点包括体内基因编辑效率低等。因此，能否利用单碱基编辑技术来提供一种治疗遗传性dfnb9耳聋的方法，并实现长期、稳定的治疗效果，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术中缺乏精准、高效治疗otof(c.2485c>t，p.q829x)突变导致的遗传性耳聋的药物和方法的问题，提供了一种用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统及其应用，所述的单碱基编辑系统在体内对otof点突变(c.2485c>t，p.q829x)能够进行精准的纠正，治疗体系在小鼠模型中成功逆转了听力损伤且恢复效果至少可以维持一年以上，实现了长期、稳定、安全的遗传性耳聋治疗作用。

2、基于上述，本发明首先提供了一种用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，所述单碱基编辑系统包括：腺嘌呤碱基编辑器和sgrna，所述sgrna的靶向序列如seqid no.1所示。

3、优选地，所述腺嘌呤碱基编辑器包含腺嘌呤脱氨酶或其酶促活性成分和ncas9蛋白。

4、优选地，所述单碱基编辑系统通过aav载体递送。

5、优选地，所述单碱基编辑系统通过双aav载体递送，包括：第一aav载体，其序列从5’端至3’端方向依次包含：腺嘌呤碱基编辑器n端片段和内含肽intein n端片段；以及，第二aav载体，其序列从5’端至3’端方向依次包含：内含肽intein c端片段、腺嘌呤碱基编辑器c端片段和sgrna表达序列。

6、优选地，所述intein n端片段的dna序列如seq id no.3所示，所述intein c端片段的dna序列如seq id no.4所示。

7、优选地，所述腺嘌呤碱基编辑器n端片段包含：编码所述腺嘌呤脱氨酶或其酶促活性成分的核苷酸序列，以及ncas9蛋白n端第1～573个氨基酸的核苷酸序列；所述腺嘌呤碱基编辑器c端片段包含：编码ncas9蛋白c端第574～1368个氨基酸的核苷酸序列。

8、优选地，所述腺嘌呤脱氨酶为tada8e多肽或tad-tada*二聚体多肽，所述ncas9蛋白为spcas9-ng、spry、spg中的任意一种。

9、更优选地，所述腺嘌呤脱氨酶为tad-tada*二聚体多肽，所述ncas9蛋白为spcas9-ng。

10、本发明另一方面还提供了一种前面所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统在制备预防和/或治疗听神经病的药物中的应用，所述药物用于治疗由otof基因发生p.q829x突变而导致dfnb9听力损失的患者，或在具有otof基因p.q829x突变的患者中预防dfnb9听力损失。

11、本发明另一方面还提供了一种预防和/或治疗听神经病的药物组合物，所述的药物组合物包括：前面所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。

12、相对于现有技术，本发明的有益效果至少包括：

13、1、本发明提供了一种用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，且通过构建模拟同源点突变小鼠模型(otof c.2482c>t；p.q828x)评价了该治疗系统对小鼠听力损失的影响。结果发现，该系统能特异靶向otofq828x/q828x小鼠内毛细胞(ihc)对点突变进行有效修复，成功地纠正了c>t的突变，且在长达一年的观察期内，持续检测到听力恢复至野生型水平，同时观察到otoferlin蛋白表达和ihc持续囊泡释放功能的恢复，直观地验证了该系统对小鼠otof(c.2482c>t，p.q828x)突变基因导致的听神经病的治疗作用，能够用于制备治疗听神经病致聋的药物。

14、2、本发明首次成功地基于单碱基编辑治疗策略在体内对otof p.q828x点突变进行精准的有效恢复，并且观察到听力恢复至少长达一年，成功地永久地逆转了听力损伤，为最终在点突变造成的遗传性耳聋中实现安全、持久的基因治疗以及潜在的临床转化提供了科学依据。

技术特征：

1.一种用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑系统包括：腺嘌呤碱基编辑器和sgrna，所述sgrna的靶向序列如seq id no.1所示。

2.如权利要求1所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，其特征在于，所述腺嘌呤碱基编辑器包含腺嘌呤脱氨酶或其酶促活性成分和ncas9蛋白。

3.如权利要求2所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑系统通过aav载体递送。

4.如权利要求3所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，其特征在于，所述单碱基编辑系统通过双aav载体递送，包括：

5.如权利要求4所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，其特征在于，所述intein n端片段的dna序列如seq id no.3所示，所述intein c端片段的dna序列如seq id no.4所示。

6.如权利要求4所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，其特征在于，所述腺嘌呤碱基编辑器n端片段包含：编码所述腺嘌呤脱氨酶或其酶促活性成分的核苷酸序列，以及ncas9蛋白n端第1～573个氨基酸的核苷酸序列；

7.如权利要求2-6中任一项所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，其特征在于，所述腺嘌呤脱氨酶为tada8e多肽或tad-tada*二聚体多肽，所述ncas9蛋白为spcas9-ng、spry、spg中的任意一种。

8.如权利要求7所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，其特征在于，所述腺嘌呤脱氨酶为tad-tada*二聚体多肽，所述ncas9蛋白为spcas9-ng。

9.如权利要求1-8中任一项所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统在制备预防和/或治疗听神经病的药物中的应用，其特征在于，所述药物用于治疗由otof基因发生p.q829x突变而导致dfnb9听力损失的患者，或在具有otof基因p.q829x突变的患者中预防dfnb9听力损失。

10.一种预防和/或治疗听神经病的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：权利要求1-8中任一项所述的用于修复otof基因p.q829x突变的单碱基编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。

技术总结本发明公开了一种用于修复OTOF基因p.Q829X突变的单碱基编辑系统及其应用。所述单碱基编辑系统包括：腺嘌呤碱基编辑器和sgRNA，所述sgRNA的靶向序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过纯合Otof<supgt;Q828X/Q828X</supgt;小鼠模型实验评价了该系统对小鼠听力损失的影响。结果发现，该系统能特异靶向Otof<supgt;Q828X/Q828X</supgt;小鼠内毛细胞对点突变进行有效修复，成功地纠正了C>T的突变，且在长达一年的观察期内，持续检测到听力恢复至野生型水平，同时观察到otoferlin蛋白表达和内毛细胞持续囊泡释放功能的恢复，直观地验证了该系统对OTOF(c.2482C>T，p.Q828X)突变基因导致的听神经病的治疗和/或预防作用，能够用于制备治疗和/或预防听神经病的药物。技术研发人员：舒易来,崔冲,汪胜义,王大奇受保护的技术使用者：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院技术研发日：技术公布日：2024/11/14