除草剂耐受性基因及其使用方法与流程

本发明总体上涉及生物。更具体地，本发明涉及编码降解合成激素类和/或accase抑制剂类除草剂的酶的重组dna分子。本发明还涉及含有重组dna分子的转基因植物、部分、种子、细胞和植物部分，以及使用它们的方法。

背景技术：

1、农作物生产通常利用使用生物技术方法产生的转基因性状。将异源基因(也称为转基因)引入植物中以产生转基因性状。转基因在植物中的表达赋予植物以期望的性状，如除草剂耐受性。转基因除草剂耐受性性状的实例包括草甘膦耐受性、草铵膦耐受性和麦草畏耐受性。随着对最常用的除草剂有抗性的杂草物种的增加，在所述领域中需要新的除草剂耐受性性状。特别感兴趣的除草剂是合成激素类除草剂。合成激素类除草剂提供对一系列抗草甘膦杂草的控制，从而产生赋予这些除草剂耐受性的特别用于与其他除草剂耐受性性状组合的作物系统中的性状。

2、从2,4-滴丙酸(dichloroprop)降解土壤样品分离的食除草剂鞘脂菌(sphingobium herbicidovorans)菌株mh被鉴定为能够裂解各种苯氧基烷酸(phyenoxyalkanoic acid)除草剂的醚键，从而利用此作为其生长的唯一碳源和能量来源(hpe kohler,journal of industrial microbiology&biotechnology(1999)23:336-340)。除草剂的分解代谢通过两种不同的对映选择性α-酮戊二酸依赖性双加氧酶rdpa(r-2,4-滴丙酸双加氧酶)和sdpa(s-2,4-滴丙酸双加氧酶)进行。(a westendorf,等人,microbiological research(2002)157:317-322；westendorf,等人,actabiotechnologica(2003)23(1):3-17)。rdpa已自食除草剂鞘脂菌(genbank登录af516752(dna)和aam90965(蛋白质))和食酸代尔夫特菌(delftia acidovorans)(genbank登录ng_036924(dna)和yp_009083283(蛋白质))(ta mueller,等人,applied and environmental microbiology(2004)70(10):6066-6075)。rdpa和sdpa基因已经用于植物转化以赋予作物以除草剂耐受性(tr wright,等人,proceedings of the national academy of sciences usa,(2010)107(47):20240-5)。使用蛋白质工程化技术改进rdpa酶的活性以产生用于转基因植物的蛋白质将允许更高的除草剂施加率，从而改进转基因作物安全性和杂草控制措施。

技术实现思路

0、发明简述

1、本发明提供一种重组dna分子，其包含编码与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的多肽的核酸序列：seq id no:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133或137。

2、在一个具体实施方式中，所述核酸序列选自由以下组成的组：seq id no:2、3、4、6、7、8、10、11、12、14、15、16、18、19、20、22、23、24、26、27、28、30、31、32、34、35、36、38、39、40、42、43、44、46、47、48、50、51、52、54、55、56、58、59、60、62、63、64、66、67、68、70、71、72、74、75、76、78、79、80、82、83、84、86、87、88、90、91、92、94、95、96、98、99、100、102、103、104、106、107、108、110、111、112、114、115、116、118、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135、136、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166或167，以及因遗传密码的简并性而与所示序列编码相同氨基酸序列的核酸序列。

3、在一个具体实施方式中，其中所述重组dna分子可操作地连接至在植物细胞中有功能的异源启动子。

4、在另一个具体实施方式中，其中所述重组dna分子进一步可操作地连接至编码叶绿体转运肽的dna分子。

5、本发明还提供一种dna构建体，其包含可操作地连接至所述的重组dna分子的在植物细胞中有功能的异源启动子。

6、在一个具体实施方式中，其还包含可操作地连接至所述重组dna分子的编码叶绿体转运肽的dna分子。

7、在另一个具体实施方式中，其中所述dna构建体存在于转基因植物的基因组中。

8、本发明提供一种植物、种子、植物组织、植物部分或细胞，其包含所述的重组dna分子。

9、在一个具体实施方式中，其中所述植物、种子、植物组织、植物部分或细胞包含对至少一种选自由以下组成的组的除草剂的耐受性：合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂。

10、本发明还提供一种植物、种子、植物组织、植物部分或细胞，其包含所述的dna构建体。

11、本发明还提供一种植物、种子、植物组织、植物部分或细胞，其包含由所述的重组dna分子编码的多肽。

12、本发明还提供一种多肽，其与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少98％或至少99％同一性：seq id no:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133或137。

13、在一个具体实施方式中，其中所述多肽对至少一种选自由以下组成的组的除草剂具有加氧酶活性：合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂。

14、本发明还提供一种用于赋予植物、种子、细胞或植物部分以除草剂耐受性的方法，所述方法包括在所述植物、种子、细胞或植物部分中表达所述的多肽。

15、在一个具体实施方式中，其中所述植物、种子、细胞或植物部分包含dna构建体，所述dna构建体包含可操作地连接至重组dna分子的在植物细胞中有功能的异源启动子，所述重组dna分子包含编码所述的多肽。

16、在另一个具体实施方式中，其中所述植物、种子、细胞或植物部分包含对至少一种选自由以下组成的组的除草剂的耐受性：合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂。

17、本发明还提供一种用于产生除草剂耐受性转基因植物的方法，所述方法包括用所述的重组dna分子或所述的dna构建体转化植物细胞或组织，和从所述转化的植物细胞或组织再生除草剂耐受性转基因植物。

18、在一个具体实施方式中，其中所述除草剂耐受性转基因植物包含对至少一种选自由以下组成的组的除草剂的耐受性：合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂。

19、本发明还提供一种用于控制植物生长区域中的杂草的方法，所述方法包括使包括植物或种子的植物生长区域与至少一种选自由合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂组成的组的除草剂接触，所述植物或种子包含所述的重组dna分子且耐受所述至少一种除草剂。

20、本发明所述的工程化蛋白质与野生型rdpa蛋白相比，不但保留了原始对苯氧羧酸类等合成激素类除草剂和/或accase抑制剂类除草剂的抗性，还增加了对吡啶基氧基酸类除草剂的抗性，拓宽了对除草剂的抗性谱。

21、发明详述

22、提供以下定义和方法以更好地限定本发明并指导本领域的普通技术人员实施本发明。除非另外说明，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。

23、工程化蛋白质和重组dna分子

24、本发明提供新颖的工程化蛋白质和编码它们的重组dna分子。如本文所用，术语“工程化的”是指通常不会在自然界中发现并且通过人为干预产生的非天然dna、蛋白质或生物体。“工程化蛋白质”是在实验室中使用一种或多种蛋白质工程化技术，如使用定点诱变的蛋白质设计和使用随机诱变和dna改组的定向进化来设想和创建其多肽序列的蛋白质。例如，工程化蛋白质可相对于野生型蛋白质的编码序列具有一个或多个缺失、插入或取代，并且每个缺失、插入或取代可由一个或多个氨基酸组成。工程化蛋白质的实例在本文提供为seq id no:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133和137。

25、本发明提供的工程化蛋白质是具有加氧酶活性的酶。如本文所用，术语“加氧酶活性”意指通过将氧从分子氧转移至底物、副产物或中间物来氧化底物的能力。本发明提供的工程化蛋白的加氧酶活性可使合成激素类除草剂和/或accase抑制剂类除草剂中的一种或多种失活。

26、如本文所用，“野生型”意指天然存在的。如本文所用，“野生型dna分子”、“野生型多肽”或“野生型蛋白质”是天然存在的dna分子、多肽或蛋白质，即在自然界中预先存在的dna分子、多肽或蛋白质。多肽、蛋白质或dna分子的野生型型式可适用于与工程化蛋白质或基因进行比较。蛋白质或dna分子的野生型型式可适用作实验中的对照。

27、如本文所用，“对照”意指为比较目的而设计的实验对照。例如，转基因植物分析中的对照植物是与实验植物(即其待测试的植物)相同类型但不含实验植物的转基因插入片段、重组dna分子或dna构建体的植物。适用于与转基因玉米植物比较的对照植物的实例是非转基因lh244玉米(美国专利号6,252,148)并且适用于与转基因大豆植物比较的对照植物的实例是非转基因a3555大豆(美国专利no.7,700,846)。

28、如本文所用，术语“重组”是指为遗传工程化的结果并且因此通常不会在自然界中发现并且通过人为干预产生的非天然dna、多肽或蛋白质。“重组dna分子”是包含不天然存在的并且因此是人为干预的结果的dna序列的dna分子，例如编码工程化蛋白质的dna分子。另一个实例是由至少两个彼此异源的dna分子(如编码蛋白质的dna分子和可操作地连接的异源启动子)的组合组成的dna分子。重组dna分子的实例是包含至少一个选自以下的序列的dna分子：seq id no:2、3、4、6、7、8、10、11、12、14、15、16、18、19、20、22、23、24、26、27、28、30、31、32、34、35、36、38、39、40、42、43、44、46、47、48、50、51、52、54、55、56、58、59、60、62、63、64、66、67、68、70、71、72、74、75、76、78、79、80、82、83、84、86、87、88、90、91、92、94、95、96、98、99、100、102、103、104、106、107、108、110、111、112、114、115、116、118、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135、136、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166和167。

29、“重组多肽”或“重组蛋白质”是包含不天然存在的氨基酸序列并且因此是人为干预的结果的多肽或蛋白质，例如工程化蛋白质。

30、术语“转基因”是指作为人为干预(如通过植物转化方法)的结果人工并入生物体基因组中的dna分子。如本文所用，术语“转基因的”意指包含转基因，例如“转基因植物”是指在其基因组中包含转基因的植物，“转基因性状”是指由并入植物基因组中的转基因的存在传递或赋予的特征或表型。作为这种基因组改变的结果，所述转基因植物是与相关的野生型植物明显不同的植物，并且转基因性状是未在野生型植物中天然发现的性状。本发明的转基因植物包含通过本发明提供的重组dna分子和工程化蛋白质。

31、如本文所用，术语“异源”是指源自不同来源且因此在自然界中通常不相关的两种或更多种物质之间的关系。例如，编码蛋白质的重组dna分子相对于可操作地连接的启动子是异源的，如果这种组合在自然界中通常不存在。此外，当特定重组dna分子不天然存在于所述特定细胞或生物体中时，其可相对于其所插入的细胞或生物体是异源的。

32、如本文所用，术语“编码蛋白质的dna分子”或“编码多肽的dna分子”是指包含编码蛋白质或多肽的核苷酸序列的dna分子。“编码蛋白质的序列”或“编码多肽的序列”意指编码蛋白质或多肽的dna序列。“序列”意指核苷酸或氨基酸的顺序排列。编码蛋白质的序列或编码多肽的序列的边界通常由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子决定。编码蛋白质的分子或编码多肽的分子可包含编码蛋白质或多肽序列的dna序列。如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白质表达”、“多肽表达”、“表达蛋白质”和“表达多肽”意指通过将dna分子转录成信使rna(mrna)并且将mrna翻译成多肽链(其可最终折叠成蛋白质)的过程产生蛋白质或多肽。编码蛋白质的dna分子或编码多肽的dna分子可以可操作地连接至dna构建体中的异源启动子，以用于在用重组dna分子转化的细胞中表达蛋白质或多肽。如本文所用，“可操作地连接”是指以使得一个dna分子可影响另一个dna分子的功能的方式连接的两个dna分子。可操作连接的dna分子可以是单个连续分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，启动子与dna构建体中的编码蛋白质的dna分子或编码多肽的dna分子可操作地连接，其中两个dna分子被排列成使得所述启动子可影响转基因的表达。

33、如本文所用，“dna构建体”是包含两个或更多个异源dna序列的重组dna分子。dna构建体适用于转基因表达，并且可包含在载体和质粒中。dna构建体可出于转化(即将异源dna引入宿主细胞中)的目的用于载体中以便产生转基因植物和细胞，并且因此也可包含在转基因植物、种子、细胞或植物部分的质粒dna或基因组dna中。如本文所用，“载体”意指可用于植物转化目的的任何重组dna分子。如序列表中所示的重组dna分子可例如作为构建体的一部分插入载体中，所述构建体具有可操作地连接至启动子的重组dna分子，所述启动子在植物中起作用以驱动由所述重组dna分子编码的工程化蛋白质的表达。用于构建dna构建体和载体的方法是本领域中熟知的。dna构建体或包含dna构建体的载体的组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：用于表达可操作地连接的dna的合适启动子、可操作地连接的编码蛋白质非人dna分子和3'非翻译区(3’-utr)。适用于实践本发明的启动子包括在植物中起作用以表达可操作地连接的多核苷酸的启动子。此类启动子是多种多样的且是本领域中熟知的，并且包括诱导型的、病毒的、合成的、组成型、时间调控型的、空间调控型的和/或时空调控型的。另外的任选组分包括但不限于以下元件中的一个或多个：5'-utr、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、叶绿体转运肽(ctp)和一个或多个选择性标记转基因。

34、本发明的dna构建体可包含可操作地连接至本发明提供的编码蛋白质的dna分子的ctp分子。适用于实践本发明的ctp包括用于促进工程化蛋白分子在细胞内定位的那些。通过促进细胞内的蛋白质定位，ctp可增加工程化蛋白质的积累，保护其免受蛋白水解降解，增强除草剂耐受性水平，并且由此降低除草剂施加后的损伤水平。用于本发明的ctp分子是本领域中已知的，包括但不限于拟南芥epsps ctp(klee等人,1987)、矮牵牛epsps ctp(della-cioppa等人,1986)、玉米cab-m7信号序列(becker等人,1992；pct wo 97/41228)和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(creissen等人,1991；pct wo 97/41228)。

35、本发明的重组dna分子可通过本领域中已知的方法完全或部分地合成和修饰，特别是在期望提供适用于dna操作的序列(如限制性酶识别位点或重组-基因克隆位点)、植物优选序列(如植物密码子使用或kozak共有序列)或适用于dna构建体设计的序列(如间隔区或接头序列)的情况下。本发明包括重组dna分子和工程化蛋白质，所述重组dna分子和工程化蛋白质与本文提供的重组dna分子或工程化蛋白质序列中的任一个，例如与包含选自由以下组成的组的序列的重组dna分子具有至少约80％(百分比)序列同一性、约85％序列同一性、约90％序列同一性、约91％序列同一性、约92％序列同一性、约93％序列同一性、约94％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性和约99％序列同一性：seq id no:2、3、4、6、7、8、10、11、12、14、15、16、18、19、20、22、23、24、26、27、28、30、31、32、34、35、36、38、39、40、42、43、44、46、47、48、50、51、52、54、55、56、58、59、60、62、63、64、66、67、68、70、71、72、74、75、76、78、79、80、82、83、84、86、87、88、90、91、92、94、95、96、98、99、100、102、103、104、106、107、108、110、111、112、114、115、116、118、119、120、122、123、124、126、127、128、130、131、132、134、135、136、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166和167。

36、如本文所用，术语“百分比序列同一性”或“％序列同一性”是指在最佳比对两个序列时(在比较窗内具有总计少于参考序列的20％的适当核苷酸或氨基酸插入、缺失或空位)，与测试(“主题”)序列(或其互补链)相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或多肽序列中的相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域的技术人员所熟知的并且可由以下工具实施：如smith和waterman的局部同源性算法、needleman和wunsch的同源性比对算法、pearson和lipman的相似性搜索方法，并且由这些算法的计算机化实现方式来实施，如使用默认参数的作为wisconsin(accelrys inc.,san diego,ca)、megalign(dnastar,inc.,1228s.park st.,madison,wis.53715)和muscle(3.6版)(rcedgar,nucleic acids research(2004)32(5):1792-1797)的一部分可获得的gap、bestfit、fasta和tfasta。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共享的相同组分的数目除以参考序列片段中组分的总数，即整个参考序列或参考序列的较小限定部分。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个序列的比较可以是针对全长序列或其一部分，或针对更长的序列。

37、可通过改变(即修饰)野生型蛋白质以产生具有有用蛋白质特征(如改变的vmax、km、底物特异性、底物选择性和蛋白质稳定性)的新颖组合的新蛋白质来产生工程化蛋白质。修饰可在蛋白质中的特定氨基酸位置进行，并且可以是在自然界(即在野生型蛋白质中)中在所述位置发现的氨基酸被不同的氨基酸取代。适用于蛋白质工程化的野生型蛋白质rdpa的氨基酸序列如seq id no:1所示。设计工程化蛋白质，所述工程化蛋白质与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少约92％序列同一性：seq id no:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133和137，并且包含这些氨基酸突变中的至少一种。因此，本发明提供的工程化蛋白质提供相对于在自然界中发现的野生型蛋白质具有一种或多种改变的蛋白质特征的新蛋白质。在本发明的一个实施方案中，与类似的野生型蛋白质或此类特征的任何组合相比，工程化蛋白质具有改变的蛋白质特征，如针对一种或多种除草剂的改进的或降低的活性或改进的蛋白质稳定性。在一个实施方案中，本发明提供工程化蛋白质和编码其的重组dna分子，其与选自由以下组成的组的工程化蛋白质序列具有至少约80％序列同一性、约85％序列同一性、约90％序列同一性、约91％序列同一性、约92％序列同一性、约93％序列同一性、约94％序列同一性、约95％序列同一性、约96％序列同一性、约97％序列同一性、约98％序列同一性和约99％序列同一性：seq id no:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133和137。氨基酸突变可作为蛋白质中的单个氨基酸取代或与一种或多种其它突变(如一个或多个其它氨基酸取代、缺失或添加)的组合进行。可如本文所描述或通过本领域的技术人员已知的任何其它方法进行突变。

38、转基因植物

39、本发明的一个方面包括包含本发明提供的重组dna分子和工程化蛋白的转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物和转基因种子。包含重组dna分子和工程化蛋白质的这些细胞、组织、植物和种子显示对合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂中的一种或多种的除草剂耐受性。

40、用于转化用于本发明的宿主植物细胞的合适方法实际上包括可将dna引入细胞(例如，其中重组dna构建体稳定整合至植物染色体中)的任何方法并且在本领域中是已知的。用于将重组dna构建体引入植物中的示例性和广泛使用的方法是土壤杆菌属转化系统，其是本领域的技术人员熟知的。转基因植物可通过植物细胞培养的方法从转化的植物细胞再生。关于转基因纯合的转基因植物(即，转基因的两个等位基因拷贝)可通过将包含单个转基因等位基因的转基因植物与其自身(例如r0植物)自花授粉(自交)以产生r1种子。所产生的r1种子的四分之一对于转基因将是纯合的。通常使用snp测定、dna测序或允许杂合子与纯合子之间的区别的热扩增测定来测试从发芽的r1种子生长的植物的接合性，称为接合性测定。

41、本发明提供的植物、种子、植物部分、植物组织和细胞显示对合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂中的一种或多种的除草剂耐受性，尤其是显示对如式ⅰ所示的吡啶基氧基酸类化合物及其盐、酯衍生物的除草剂耐受性。

42、在本发明中，“合成激素类除草剂”是本身有除草活性的物质或者与能改变其效果的其他除草剂和/或添加剂合用的物质，其属于植物激素干扰型除草剂，在本领域中是熟知的，例如包括以下有效成分或其衍生物中的至少一种：

43、(1)吡啶羧酸类(pyridine carboxylic acids)：氨氯吡啶酸(毒莠定)、氯氟吡氧乙酸(氟草烟)、氯氟吡氧乙酸异辛酯、氯氨吡啶酸、二氯吡啶酸、三氯吡氧乙酸(绿草定)、氯氟吡啶酯、氟氯吡啶酯、如式ⅰ所示的吡啶基氧基酸类化合物及其盐、酯衍生物等；

44、(2)苯甲酸类(benzoic acids)：麦草畏、草灭平、草芽畏、萘草胺等；

45、(3)苯氧羧酸类(phenoxycarboxylic acids)：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、2,4-二氯苯氧丁酸(2,4-d丁酸)、2,4-d异丙酸、氯甲酰草胺、二甲四氯、二甲四氯异丙酸、二甲四氯丁酸等；

46、(4)喹啉羧酸类(quinoline carboxylic acids)：二氯喹啉酸、氯甲喹啉酸等；

47、(5)其他：草除灵等。

48、所述如式ⅰ所示的吡啶基氧基酸类化合物及其盐、酯衍生物，

49、

50、其中，a、b分别独立地代表卤素、c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、c3-c6环烷基；

51、c代表氢、卤素、c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基；

52、q代表c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、卤素、氰基、氨基、硝基、甲酰基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷氧羰基、羟基c1-c6烷基、c1-c6烷氧基c1-c2烷基、氰基c1-c2烷基、c1-c6烷氨基c1-c2烷基、苄基、萘基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基，以及未取代或被c1-c6烷基取代的未取代或被c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、卤素和c1-c6烷氧基中的至少一个基团所取代的苯基；

53、y代表氨基、c1-c6烷基氨基、c1-c6烷基羰基氨基、苯基羰基氨基、苄基氨基、未取代或卤代c1-c6烷基取代的呋喃基亚甲基氨基；

54、所述盐为金属盐、铵盐nh4+、伯胺盐rnh2、仲胺盐(r)2nh、叔胺盐(r)3n、季胺盐(r)4n+、吗啉盐、哌啶盐、吡啶盐、氨基丙基吗啉盐、jeff胺d-230盐、2,4,6-三(二甲基氨基甲基)苯酚和氢氧化钠的盐、c1-c14烷基锍盐、c1-c14烷基氧化锍盐、c1-c14烷基鏻盐、c1-c14烷醇鏻盐；

55、其中，r分别独立地代表未取代的c1-c14烷基、c2-c12烯基、c2-c12炔基、c3-c12环烷基或苯基，以及c1-c14烷基任选地被一个或多个以下基团取代：卤素、羟基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷硫基、羟基c1-c6烷氧基、氨基、c1-c6烷基氨基、氨基c1-c6烷基氨基、苯基；

56、所述酯为其中，x代表o或s；

57、m代表c1-c18烷基、卤代c1-c8烷基、c3-c6环烷基、c2-c6烯基、卤代c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷氧羰基、c1-c6烷基磺酰基、氰基c1-c2烷基、硝基c1-c2烷基、c1-c6烷氧基c1-c2烷基、c1-c6烷氧羰基c1-c2烷基、c2-c6烯氧基羰基c1-c2烷基、-(c1-c2烷基)-z、四氢呋喃基、吡啶基、萘基、呋喃基、噻吩基、以及未取代或c1-c6烷基取代的未取代或被c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基、c1-c6烷基氨基、卤素或c1-c6烷氧基取代的苯基；

58、z代表四氢呋喃基、吡啶基、噻吩基、呋喃基、萘基，以及未取代或被c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、卤代c1-c6烷基、氰基和卤素中的至少一个基团取代的苯基；

59、r3分别独立地代表c1-c6烷基；

60、r4、r5、r6分别独立地代表氢、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基羰基；

61、r’代表氢、c1-c6烷基、卤代c1-c6烷基。

62、在一个实施方案中，所述通式化合物i和i-1均为r构型(*处碳原子为手性中心)。在另一个实施方案中，所述通式化合物i中a代表氯、b代表氯、c代表氟、y代表氨基、q代表甲基，且为r构型(*处碳原子为手性中心)(即化合物a)；所述通式化合物i-1中a代表氯、b代表氯、c代表氟、y代表氨基、q代表甲基，x代表o，m代表甲基，且为r构型(*处碳原子为手性中心)(即化合物b)；或者所述通式化合物i-1中a代表氯、b代表氯、c代表氟、y代表氨基、q代表甲基，x代表o，m代表四氢呋喃-2-基甲基且为r构型(即化合物c)(*处碳原子为手性中心)。

63、在本发明中，“accase抑制剂类除草剂”是指以乙酰辅酶a羧化酶为作用靶标的除草剂，在本领域中是熟知的，例如包括以下有效成分或其衍生物中的至少一种：

64、(1)芳氧苯氧丙酸类：精喹禾灵、炔草酯、氰氟草酯、禾草灵、精噁唑禾草灵、精吡氟禾草灵、高效氟吡禾草灵、噁唑酰草胺、噁草酸、喹禾糠酯等；

65、(2)环己烯酮类：禾草灭、烯草酮、环苯草酮、丁苯草酮、噻草酮、烯禾啶、吡喃草酮、三甲苯草酮等；

66、(3)苯并吡啶类：唑啉草酯等。

67、在本说明书的上下文中，如果使用活性化合物的通用名称的缩写形式，则在每种情况下包括所有的常规衍生物，例如酯和盐，以及异构体，特别是光学异构体，特别是一种或多种市售形式。如果通用名称表示酯或盐，则在每种情况下还包括所有其他的常规衍生物，例如其他的酯和盐、游离酸和中性化合物，以及异构体，特别是光学异构体，特别是一种或多种市售形式。给出的化合物的化学名称表示至少一种被通用名称涵盖的化合物，通常是优选的化合物。例如，2,4-d或2,4-d丁酸衍生物包含但不限于：2,4-d或2,4-d丁酸盐如钠盐、钾盐、二甲铵盐、三乙醇铵盐、异丙胺盐、胆碱等，以及2,4-d或2,4-d丁酸酯如甲酯、乙酯、丁酯、异辛酯等；二甲四氯衍生物包含但不限于：二甲四氯钠盐、钾盐、二甲铵盐、异丙胺盐等，以及二甲四氯甲酯、乙酯、异辛酯、乙硫酯等。

68、除草剂可施加至包含本发明提供的植物和种子的植物生长区域作为控制杂草的方法。本发明提供的植物和种子包含除草剂耐受性性状，且因此耐受一种或多种合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂的施加。在施加除草剂时，植物生长区可包括或可不包括杂草植物。

69、除草剂施加可依次与几种合成激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂或任何其它相容性除草剂中的一种、两种或组合槽混。一种除草剂或两种或更多种除草剂组合或单独的多次施加可在生长季节内用于包含本发明的转基因植物的区域以用于控制广谱双子叶杂草、单子叶杂草或两者，例如，两次施加(如种植前施加和芽后施加或芽前施加和芽后施加)或三次施加(如种植前施加、芽前施加和芽后施加或芽前施加和两次芽后施加)。

70、如本文所用，“抗性”、“除草剂抗性”、“耐受性”或“除草剂耐受性”意指植物、种子、植物组织、植物部分或细胞抵抗一种或多种除草剂的毒性作用的能力。植物、种子、植物组织、植物部分或细胞的除草剂耐受性可通过将植物、种子、植物组织、植物部分或细胞与合适的对照进行比较来测量。例如，除草剂耐受性可通过将除草剂施加至包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组dna分子的植物(测试植物)和不包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组dna分子的植物(对照植物)，且然后比较两种植物的植物损伤，其中测试植物的除草剂耐受性通过与对照植物的损伤率相比减少的损伤率指示。当与对照植物、种子、植物组织、植物部分或细胞相比时，除草剂耐受性植物、种子、植物组织、植物部分或细胞显示对除草剂的毒性作用的反应降低。如本文所用，“除草剂耐受性性状”是与野生型植物或对照植物相比赋予植物改善的除草剂耐受性的转基因性状。

71、本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞和植物部分还可含有一种或多种另外的转基因性状。可通过使含有包含本发明提供的重组dna分子的转基因的植物与含有另外的转基因性状的另一种植物杂交来引入另外的转基因性状。如本文所用，“杂交”意指培育两种单独的植物以产生子代植物。因此，两种转基因植物可杂交以产生含有转基因性状的子代。如本文所用，“子代”意指亲本植物的任何传代的后代，并且转基因子代包含由本发明提供并且从至少一种亲本植物遗传的dna构建体。或者，可通过用包含本发明提供的重组dna分子的dna构建体共转化所述另外的转基因性状的dna构建体(例如，其中所有的dna构建体呈现为用于植物转化的同一载体的部分)或通过将另外的性状插入包含本发明提供的dna构建体的转基因植物中或反之亦然(例如，通过使用关于转基因植物或植物细胞的植物转化的任何方法)来引入另外的转基因性状。此类另外的转基因性状包括但不限于增加的昆虫抗性、增加的水利用效率、增加的产量性能、增加的抗旱性、增加的种子质量、改进的营养品质、杂交种种子生产和除草剂耐受性，其中性状是相对于野生型植物或对照植物测量的。此类另外的转基因性状是本领域的技术人员已知的；例如，美国农业部(usda)动物和植物健康检查局(aphis)提供了此类性状的列表，并且可在它们的网站www.aphis.usda.gov上找到。

72、含有本发明提供的转基因性状的转基因植物和子代可与本领域中通常已知的任何培育方法一起使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物系中，转基因性状可在包含三种或更多种转基因性状的植物系中独立地分离、连接或两者的组合。还考虑与亲本植物的回交和与非转基因植物的异交，以及无性繁殖。通常用于不同性状和作物的培育方法的描述是本领域的技术人员熟知的。为了证实转基因在特定植物或种子中的存在，可进行多种测定。此类测定包括例如分子生物学测定，如dna印迹和rna印迹、pcr和dna测序；生物化学测定，如例如通过免疫学方法(elisa和蛋白质印迹)或通过酶功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，如叶或根测定；以及还有通过分析整株植物的表型。

73、作为回交转化过程的结果实现转基因性状向植物基因型的基因渗入。其中已经基因渗入转基因性状的植物基因型可称为回交转化的基因型、系、近交植物或杂交种。类似地，缺乏所需转基因性状的植物基因型可称为未转化的基因型、系、近交植物或杂交种。

74、如本文所用，术语“包含”是指“包括但不限于”。