一种人ECRG4免疫微球检测试剂盒的制作方法

本发明属于免疫检测领域，具体公开了一种人ecrg4免疫微球，以及含有上述微球的检测试剂盒。

背景技术：

1、ecrg4基因，全称食道癌相关基因4，是一个与多种生物学过程紧密相关的基因。近年来的研究表明，ecrg4基因在肿瘤发生、发展及转移过程中起着重要的作用，尤其是在食道癌、胃癌等消化系统肿瘤中表现尤为突出。因此，对ecrg4基因的研究不仅有助于深入理解肿瘤的发生机制，也为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。

2、目前主流的ecrg4基因的检测方法是elisa检测法，是一种基于酶联免疫吸附技术的检测方法，可用于检测血清、组织液等体液中ecrg4蛋白的含量。这种方法操作简便、快速，具有较高的灵敏度和特异性，适用于大规模样本的筛查和检测。通过使用高质量的ecrg4检测试剂盒，可以实现对ecrg4蛋白含量的准确测定，为肿瘤的诊断和预后评估提供有力支持。但是上述的elisa检测法具有以下缺点：elisa实验需要经过多个步骤，包括包被、洗涤、封闭、加样、洗涤、加入酶标试剂、显色等，整个实验过程较为繁琐，需要耗费大量的时间和人力，同时elisa检测法可能会出现假阳性结果，即实验结果与实际情况不符，需要结合其他检测方法进行验证和确认；进一步的，目前的elisa检测法在低浓度下的线性度不好，限制了其得到更精准的结果。

技术实现思路

1、基于现有技术存在的不足，本发明公开了一种人ecrg4免疫微球检测试剂盒。

2、本发明包括以下技术方案：

3、一种人ecrg4免疫微球，由以下步骤制备：

4、1)抗ecrg4多克隆抗体制备

5、基因合成人ecrg4基因表达序列,插入到真核表达质粒pcdna3.1中，构建成真核表达质粒pcdna3.1-ecrg4，该质粒肌肉注射免疫家兔，连续免疫若干次，每次间隔时间若干周，免疫完成后若干天，心脏取血，离心分离血清，过亲和层析柱，回收抗ecrg4多克隆抗体；

6、2)制备ecrg4蛋白流式检测微球；

7、21)微球处理：称取若干微球置于有盖圆底离心管内，加入适量丙酮，混匀封闭后放置摇床过夜，离心，蒸馏水洗，蒸馏水重悬，室温保存；

8、22)免疫微球包被：将ecrg4多克隆抗体适量包被缓冲溶液混合，之后加入适量混匀后的微球，置摇床接近冰点温度过夜包被；次日离心后用tween20/pbs洗涤若干次，用适当浓度bsa/pbs封闭包被后的微球，置于摇床室温孵育，离心，tween 20/pbs洗涤若干次，洗涤后微球用pbs重悬，接近冰点温度保存备用。

9、优选的，上述一种人ecrg4免疫微球，所述步骤1)中，基因合成人ecrg4基因表达序列,插入到真核表达质粒pcdna3.1中，构建成真核表达质粒pcdna3.1-ecrg4，该质粒100μg肌肉注射免疫家兔，连续免疫3次，每次间隔时间2周，第三次免疫后10天，心脏取血。

10、优选的，上述一种人ecrg4免疫微球，所述步骤21)中，称取100mg微球置于有盖圆底离心管内，加入2ml hplc级丙酮，混匀封闭后放置摇床过夜，1000r/min离心10分钟，蒸馏水洗6遍，2.5ml蒸馏水重悬，室温保存。

11、优选的，上述一种人ecrg4免疫微球，所述步骤22)中，将30μl ecrg4多克隆抗体分别与920μl包被缓冲溶液混合，之后加入混匀后的50μl，3×104个微球；抗体与微球比例为15ug抗体：1mg微球，置摇床4℃冰箱过夜；次日1000r/m离心10min，0.05％ tween 20/pbs洗涤3次；用2％ bsa/pbs封闭包被后的微球，置于摇床室温孵育2h；1000r/m离心10min，0.05％ tween20/pbs洗涤3次；洗涤后微球分别用1ml pbs重悬，微球终浓度均为2mg/ml，4℃保存备用。

12、本发明还公开了一种人ecrg4免疫微球检测试剂盒，含有上述的人ecrg4免疫微球。

13、优选的，上述一种人ecrg4免疫微球检测试剂盒，还包括0.05％ tween20/pbs洗涤液，0.01％ pbs重悬液、fitc标记的兔抗人多克隆抗体，所述fitc标记的兔抗人多克隆抗体由在ecrg4多克隆抗体上添加fitc标记得到。

14、本发明还公开了上述人ecrg4免疫微球检测试剂盒在制备治疗食道癌的药物中的用途。

15、进一步的，在上述用途中，包括以下检测方法：

16、1)反应：吸取50μl包被好的检测微球混匀，加入50μl待检液体，室温震荡孵育2h；1500r/m离心5分钟，弃上清，用0.05％ tween 20/pbs洗涤3次，之后分别用50μl 0.01％pbs重悬；加入10μg/ml fitc标记的兔抗人多克隆抗体10μl，室温震荡孵育30min，洗涤后加600μl pbs重悬；

17、2)流式细胞仪检测：在流式细胞仪上用cxp2.0软件进行检测，计数1500-2000个微球,通过在流式细胞仪上检测微球上fitc的荧光强度,即可间接检测待检液体中ecrg4蛋白的含量。

18、进一步的，在上述用途中，所述待检液体为人类外周血，进一步的，可以为血清。

19、相比现有技术，本发明具有如下突出的有益效果：

20、本发明公开了一种人ecrg4免疫微球，以及含有上述微球的检测试剂盒，本方法制备的微球稳定性好，在4℃荧光变化非常小，储存于4℃至少可稳定45天；本发明还公开了利用上述微球对人外周血中ecrg4分子标记蛋白的检测方法，检测灵敏度为15.0pg/ml,线性范围是15-6000pg/ml,批内重复性变异系数为6.1-10.4％；使用本试剂盒可以快速方便的对人ecrg4分子标记蛋白进行快速检测，相比现有的elisa检测试剂盒通常的灵敏度30.0pg/ml，80-5000pg/ml的线性范围具有更大的优越性，特别是低浓度范围内的线性度更好。

技术特征：

1.一种人ecrg4免疫微球，其特征在于，由以下步骤制备：

2.根据权利要求1所述的一种人ecrg4免疫微球，其特征在于，所述步骤1)中，基因合成人ecrg4基因表达序列,插入到真核表达质粒pcdna3.1中，构建成真核表达质粒pcdna3.1-ecrg4，该质粒100μg肌肉注射免疫家兔，连续免疫3次，每次间隔时间2周，第三次免疫后10天，心脏取血。

3.根据权利要求1所述的一种人ecrg4免疫微球，其特征在于，所述步骤21)中，称取100mg微球置于有盖圆底离心管内，加入2ml hplc级丙酮，混匀封闭后放置摇床过夜，1000r/min离心10分钟，蒸馏水洗6遍，2.5ml蒸馏水重悬，室温保存。

4.根据权利要求1所述的一种人ecrg4免疫微球，其特征在于，所述步骤22)中，将30μlecrg4多克隆抗体分别与920μl包被缓冲溶液混合，之后加入混匀后的50μl，3×104个微球；抗体与微球比例为15ug抗体：1mg微球，置摇床4℃冰箱过夜；次日1000r/m离心10min，0.05％tween 20/pbs洗涤3次；用2％bsa/pbs封闭包被后的微球，置于摇床室温孵育2h；1000r/m离心10min，0.05％tween 20/pbs洗涤3次；洗涤后微球分别用1ml pbs重悬，微球终浓度均为2mg/ml，4℃保存备用。

5.一种人ecrg4免疫微球检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1-4任一项所述的人ecrg4免疫微球。

6.根据权利要求5所述的一种人ecrg4免疫微球检测试剂盒，其特征在于，还包括0.05％tween 20/pbs洗涤液，0.01％pbs重悬液、fitc标记的兔抗人多克隆抗体，所述fitc标记的兔抗人多克隆抗体由在ecrg4多克隆抗体上添加fitc标记得到。

7.如权利要求7所述的人ecrg4免疫微球检测试剂盒在制备治疗食道癌的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，包括以下检测方法：

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述待检液体为人类外周血。

技术总结本发明属于免疫检测领域，具体公开了一种人ECRG4免疫微球，以及含有上述微球的检测试剂盒；本发明公开了上述人ECRG4免疫微球的快速高效的制备方法，包括1)抗ECRG4多克隆抗体制备、2)制备ECRG4蛋白流式检测微球、21)微球处理、22)免疫微球包被；本方法制备的微球稳定性好，在4℃荧光变化非常小，储存于4℃至少可稳定45天；本发明还公开了利用上述微球对人外周血中ECRG4分子标记蛋白的检测方法，本发明公开的试剂盒相比现有的elisa检测试剂盒具有更好的灵敏度和线性范围。技术研发人员：杨林军,金晓燕,张瑾受保护的技术使用者：台州市立医院技术研发日：技术公布日：2024/11/14