高效体外扩增用NK细胞培养液及NK细胞培养方法与流程

本发明涉及免疫细胞领域技术，尤其是指一种高效体外扩增用nk细胞培养液及nk细胞培养方法。

背景技术：

1、nk细胞，是一群较大的颗粒化的淋巴细胞，能自发地溶解多种肿瘤细胞和被病毒感染的细胞，被称为自然杀伤细胞，因其表面缺少t细胞和b细胞的特异性标志如tcr和bcr，也被称为裸细胞；nk细胞不依赖于抗原刺激，主要存在于外周血和脾脏中，在人外周血中占淋巴细胞的5％-10％。与t细胞、b细胞相比，nk细胞表面标志的特异性是相对的。部分nk细胞cd2、cd3和cd8阳性，表达il-2受体β链(p75,cd122)，cd11b/cd18阳性。常用检测nk细胞的标记有cd16、cd56、cd3、cd59、cd11b、cd94和lak-1。

2、nk细胞是机体重要的免疫细胞，也是人体防御体系的一道屏障。nk细胞在清除损伤细胞、衰老细胞、外来细菌、病毒及癌变细胞的同时，还具有很强的免疫调节功能，与其他免疫细胞相互作用，调节机体的免疫状态和免疫功能。临床研究还发现，nk细胞还能激活新的细胞，加速人体代谢循环，助力人体机能恢复，延缓衰老，保持年轻态。但是，nk细胞不会一直强大。nk细胞会随着人体年龄的增长、发育逐渐减少，且其战斗力也会不断下降。年龄、压力、睡眠不足、工作过劳、营养不足、暴露在病菌毒素之下等因素，都会降低nk细胞的活性，使其在病变细胞面前溃不成军。

3、目前，在nk细胞的体外扩增培养过程中，常采用alys505nk-ex培养基培养作为主要培养基，il-2、il-15作为用于刺激nk细胞体外扩增的细胞因子。然而，目前多种研究结果显示上述培养体系的稳定性较差，细胞扩增效果较差甚至失败，而且扩增出来的nk细胞的数量、活率及纯度较低。因此，高效体外扩增用nk细胞培养液及nk细胞培养方法则成为nk细胞治疗的关键问题之一。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种高效体外扩增用nk细胞培养液及nk细胞培养方法，其依据本发明培养出的细胞，细胞活率达80％以上，而且数量充足、细胞稳定性；本发明对于nk细胞的规模化生产具有较高的价值，适用于推广应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：

3、一种高效体外扩增用nk细胞培养液，包括第一培养液和第二培养液，该第一培养液由基础培养基、白蛋白、dpbs、il-2、l-5、il-7、il-21和抗人cd28抗体组成；该第二培养液由基础培养基、dpbs、il-2和抗人cd28抗体组成。

4、作为一种优选方案：所述第一培养液是在基础培养基中加入4％-15％白蛋白、3％-5％dpbs、1000～2500iu/ml浓度的il-2、50～100ug/ml浓度的il-5、10～50ug/ml浓度的il-7、5～50ug/ml浓度的il-21和10-140ug/ml抗人cd28抗体。

5、作为一种优选方案：所述第一培养液是在基础培养基中加入8％白蛋白、3％dpbs、1500iu/ml浓度的il-2、70ug/ml浓度的il-5、45ug/ml浓度的il-7、45ug/ml浓度的il-21和70ug/ml抗人cd28抗体；该基础培养基为t细胞扩增无血清培养基。

6、作为一种优选方案：所述第二培养液是在基础培养基中加入0.1％-2％dpbs、1000～2500iu/ml浓度的il-2和10-140ug/ml抗人cd28抗体。

7、作为一种优选方案：所述第二培养液是在基础培养基中加入2％dpbs、1500iu/ml浓度的il-2和140ug/ml抗人cd28抗体；该基础培养基为t细细胞扩增无血清培养基。

8、使用高效体外扩增用nk细胞培养液的nk细胞培养方法，包括如下步骤：

9、s1、取单个核细胞复苏后，加入基础培养基离心，上清留样，得到细胞沉淀；

10、s2、将步骤s1中的细胞沉淀加入20％-25％的第一培养液中，混匀取样计数，置于37℃、5％co2的co2培养箱中培养；

11、s3、在第3天进行加液操作，加入20％-30％的第一培养液；

12、s4、第5天进行加液操作,加入45％-60％的第一培养液；

13、s5、第7天进行吹瓶操作并加入5％-10％的第二培养液；

14、s6、第9天进行扩瓶操作，加入10％-20％的第二培养液扩瓶，混匀后，均分到2个培养瓶中；

15、s7、第11天进行转袋操作，使用第二培养液转袋，每个培养袋转入10％-15％的第二培养液，共2个培养袋；

16、s8、第14天进行补液操作，使用第二培养液补液，每个培养袋补10％-15％的第二培养液；第16天、第19天也使用第二培养液进行补液操作，每个培养袋补2.5％-10％的第二培养液；

17、s9、第22天进行收集细胞。

18、作为一种优选方案：所述步骤s1中单个核细胞为脐血来源或者外周血来源，其数量不低于100万，复苏时温度为37-40摄氏度，离心参数为：300-500g，8-10min。

19、作为一种优选方案：所述步骤s6、步骤s7和步骤s8在操作前均需要计数与观察，步骤s6中的计数密度不低于1.0*106个/ml；步骤s7中的计数密度不低于1.5*106个/ml,转袋结束后需要从每个培养袋各取一定量，用于细菌及真菌检测；步骤s8中的计数密度不低于1*106个/ml，若低于此密度延迟1-2天。

20、作为一种优选方案：所述步骤s9中nk细胞的正常培养时间为22天，在22天中观察并计数，数量大于60亿即可收取细胞；收获时，取出细胞，用生理盐水清洗细胞表面，检测细胞活率、数量及细胞表型，剩余细胞作冻存处理。

21、作为一种优选方案：所述步骤s1至步骤s9中培养瓶均置于培养箱中于37℃，5％co2培养，从培养箱中取出细胞培养瓶时，采用水平托盘水平移出。

22、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，依据本发明培养出的细胞，细胞活率达80％以上，而且数量充足、细胞稳定性；本发明对于nk细胞的规模化生产具有较高的价值，适用于推广应用；通过优化提升单个核细胞的接种、扩增和细胞收获步骤，完成nk细胞的大规模制备；本发明的有益效果：采用该方法可在体外大规模扩增，而且操作简单，得到的nk细胞活率高，可满足临床或学术研究的多种应用需求。

23、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。

技术特征：

1.一种高效体外扩增用nk细胞培养液，其特征在于：包括第一培养液和第二培养液，该第一培养液由基础培养基、白蛋白、dpbs、il-2、l-5、il-7、il-21和抗人cd28抗体组成；该第二培养液由基础培养基、dpbs、il-2和抗人cd28抗体组成。

2.根据权利要求1所述的高效体外扩增用nk细胞培养液，其特征在于：所述第一培养液是在基础培养基中加入4％-15％白蛋白、3％-5％dpbs、1000～2500iu/ml浓度的il-2、50～100ug/ml浓度的il-5、10～50ug/ml浓度的il-7、5～50ug/ml浓度的il-21和10-140ug/ml抗人cd28抗体。

3.根据权利要求2所述的高效体外扩增用nk细胞培养液，其特征在于：所述第一培养液是在基础培养基中加入8％白蛋白、3％dpbs、1500iu/ml浓度的il-2、70ug/ml浓度的il-5、45ug/ml浓度的il-7、45ug/ml浓度的il-21和70ug/ml抗人cd28抗体；该基础培养基为t细胞扩增无血清培养基。

4.根据权利要求1所述的高效体外扩增用nk细胞培养液，其特征在于：所述第二培养液是在基础培养基中加入0.1％-2％dpbs、1000～2500iu/ml浓度的il-2和10-140ug/ml抗人cd28抗体。

5.根据权利要求4所述的高效体外扩增用nk细胞培养液，其特征在于：所述第二培养液是在基础培养基中加入2％dpbs、1500iu/ml浓度的il-2和140ug/ml抗人cd28抗体；该基础培养基为t细细胞扩增无血清培养基。

6.一种使用权利要求1-5中任一项所述的高效体外扩增用nk细胞培养液的nk细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的nk细胞培养方法，其特征在于：所述步骤s1中单个核细胞为脐血来源或者外周血来源，其数量不低于100万，复苏时温度为37-40摄氏度，离心参数为：300-500g，8-10min。

8.根据权利要求6所述的nk细胞培养方法，其特征在于：所述步骤s6、步骤s7和步骤s8在操作前均需要计数与观察，步骤s6中的计数密度不低于1.0*106个/ml；步骤s7中的计数密度不低于1.5*106个/ml,转袋结束后需要从每个培养袋各取一定量，用于细菌及真菌检测；步骤s8中的计数密度不低于1*106个/ml，若低于此密度延迟1-2天。

9.根据权利要求6所述的nk细胞培养方法，其特征在于：所述步骤s9中nk细胞的正常培养时间为22天，在22天中观察并计数，数量大于60亿即可收取细胞；收获时，取出细胞，用生理盐水清洗细胞表面，检测细胞活率、数量及细胞表型，剩余细胞作冻存处理。

10.根据权利要求6所述的nk细胞培养方法，其特征在于：所述步骤s1至步骤s9中培养瓶均置于培养箱中于37℃，5％co2培养，从培养箱中取出细胞培养瓶时，采用水平托盘水平移出。

技术总结本发明公开一种高效体外扩增用NK细胞培养液及NK细胞培养方法，涉及免疫细胞技术领域，该种高效体外扩增用NK细胞培养液包括第一培养液和第二培养液，该第一培养液由基础培养基、白蛋白、DPBS、IL‑2、L‑5、IL‑7、IL‑21和抗人CD28抗体组成；所述第一培养液是在基础培养基中加入4％‑15％白蛋白、3％‑5％DPBS、1000～2500iU/mL浓度的IL‑2、50～100ug/mL浓度的IL‑5、10～50ug/mL浓度的IL‑7、5～50ug/mL浓度的IL‑21和10‑140ug/mL抗人CD28抗体；所述第二培养液是在基础培养基中加入0.1％‑2％DPBS、1000～2500iU/mL浓度的IL‑2和10‑140ug/mL抗人CD28抗体；其依据本发明培养出的细胞，细胞活率达80％以上，而且数量充足、细胞稳定性；本发明对于NK细胞的规模化生产具有较高的价值，适用于推广应用。技术研发人员：刘俊翔,韩思齐,钟桂强,王清芳,张芬,梁晓,邢岚受保护的技术使用者：深圳市北科生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/14