提高米卡芬净前体FR901379产量的方法及其应用

本技术涉及合成生物学，尤其涉及提高米卡芬净前体fr901379产量的方法及其应用。

背景技术：

1、工业菌株中目标化合物的高效合成受到多种因素共同影响，包括前体供应、竞争途径、产物耐受性、菌丝发酵形态和发酵性能等，这些都与底盘细胞中心代谢和工业性状密切相关。目前工业上fr901379的发酵水平比较低。此前也有采用丝状真菌coleophomasp.mefc009可以合成米卡芬净的前体化合物fr901379的相关报道，但是其遗传改造效率低且方法有限，对coleophoma sp.进行代谢工程改造受到阻碍，导致米卡芬净价格昂贵且应用受到限制。

2、提高工程菌发酵性能的关键在于如何实现底盘细胞与合成途径高效适配，由于底盘代谢及调控网络错综复杂，如何快速准确地锁定菌株生产性能的关键靶标非常困难。改变表观遗传修饰和全局调控因子这些非靶向调控基因通常会对细胞的一些生理代谢产生影响，因此精准调控非靶向调控基因对于调控代谢及调控网络尤为重要。但目前未有通过调控非靶向调控基因调节fr901379发酵合成过程的前例。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提出一种基于理性设计的非靶向扰动策略来快速锁定与生产性状相关的代谢及调控模块，即通过敲除或过表达表观遗传修饰因子(组蛋白甲基转移酶ccla、去乙酰化酶hdaa)，全局调控因子(laea、vea、velb)，以及cop9信号复合体csne亚基对鞘茎点霉属真菌(coleophoma sp.)代谢网络产生非靶向扰动，获得米卡芬净前体fr901379产量不同的突变菌株集，进而通过对关键基因过表达，构建fr901379高效细胞工厂。

2、一方面，本技术提供了非靶向调控基因在制备米卡芬净前体fr901379中的应用，所述非靶向调控基因选自表观遗传修饰因子、全局调控因子、cop9信号复合体亚基中的一种或多种。

3、优选的，所述非靶向调控基因在制备米卡芬净前体fr901379中的应用是通过调控工程菌中非靶向调控基因的表达进而实现控制工程菌制备米卡芬净前体fr901379产量。

4、在一种优选的实施方式中，所述工程菌为coleophoma sp.mefc009，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.21058。

5、在一种优选的实施方式中，所述工程菌还敲除ku80蛋白。可以理解的是，本技术中仅是给出了一种鞘茎点霉属真菌(coleophoma sp.)工程菌作为实验材料进行验证，本领域技术人员可以自行选择其他的已知制备米卡芬净前体fr901379的鞘茎点霉属工程菌进行改造。

6、进一步地，所述表观遗传修饰因子选自组蛋白甲基转移酶ccla、组蛋白去乙酰化酶hdaa中的一种或多种；和/或，所述全局调控因子选自laea、vea、velb中的一种或多种；和/或，所述cop9信号复合体的亚基包括csne。

7、其中，组蛋白甲基转移酶ccla的氨基酸序列如seq id no.1所示、核苷酸序列如seq id no.2所示；

8、组蛋白去乙酰化酶hdaa的氨基酸序列如seq id no.3所示、核苷酸序列如seq idno.4所示；

9、全局调控因子laea的氨基酸序列如seq id no.5所示、核苷酸序列如seq id no.6所示；

10、全局调控因子vea的氨基酸序列如seq id no.7所示、核苷酸序列如seq id no.8所示；

11、全局调控因子velb的氨基酸序列如seq id no.9所示、核苷酸序列如seq idno.10所示；

12、cop9信号复合体csne亚基的氨基酸序列如seq id no.11所示、核苷酸序列如seqid no.12所示。

13、另一方面，本技术还提供了非靶向调控基因在调控菌株生长发育和/或菌丝形态中的应用，所述非靶向调控基因选自表观遗传修饰因子、全局调控因子、cop9信号复合体的亚基中的一种或多种；优选的，所述菌株为鞘茎点霉属真菌(coleophoma sp.)。

14、进一步地，所述表观遗传修饰因子选自组蛋白甲基转移酶ccla、组蛋白去乙酰化酶hdaa中的一种或多种；和/或，所述全局调控因子选自laea、vea、velb中的一种或多种；和/或，所述cop9信号复合体的亚基包括csne。

15、优选的，非靶向调控基因在调控菌株生长发育和/或菌丝形态中的应用是通过调控工程菌中非靶向调控基因的表达进而实现调控菌株生长发育和/或菌丝形态。

16、所述菌株生长发育包括但不限于菌株的生长速度、产孢量、菌落直径等通用指标，所述菌丝体形态包括但不限于菌株菌丝体褶皱、菌丝体大小、菌丝体密度、菌丝体颜色、菌丝体整体形状等通用指标。

17、在一种优选的实施方式中，所述应用包括：敲除工程菌ccla和/或csne基因，突变体的生长速度极慢。

18、在一种优选的实施方式中，所述应用包括：敲除工程菌ccla基因，工程菌菌丝体褶皱变多，中间向上凸起，产孢量减少。

19、在一种优选的实施方式中，所述应用包括：敲除工程菌hdaa基因，工程菌径向沟槽减少。

20、在一种优选的实施方式中，所述应用包括：敲除工程菌csne基因，工程菌产孢量减少，菌丝体紧密聚集成小团。

21、在一种优选的实施方式中，所述应用包括：敲除工程菌laea基因，工程菌径向沟槽更为完整和明显，且表面呈平面状。

22、在一种优选的实施方式中，所述应用包括：敲除工程菌vea基因，工程菌菌丝体更加松软。

23、在一种优选的实施方式中，所述应用包括：敲除工程菌velb基因，工程菌表面呈灰色，并有一层分生孢子。

24、另一方面，本技术还提供了一种提高米卡芬净前体fr901379产量的方法，所述方法包括：调控工程菌中非靶向调控基因的表达；所述非靶向调控基因选自表观遗传修饰因子、全局调控因子、cop9信号复合体亚基中的一种或多种。

25、其中，调控工程菌中非靶向调控基因的表达包括调控非靶向调控基因的上调或下调，或指抑制和/或促进非靶向调控基因的表达过程以达到控制非靶向调控基因表达量的目的。

26、进一步地，所述表观遗传修饰因子选自组蛋白甲基转移酶ccla、组蛋白去乙酰化酶hdaa中的一种或多种；和/或，所述全局调控因子选自laea、vea、velb中的一种或多种；和/或，所述cop9信号复合体的亚基包括csne；和/或，所述工程菌为鞘茎点霉属真菌(coleophoma sp.)。

27、进一步地，所述方法包括：抑制cop9信号复合体csne亚基和/或全局调控因子velb的表达；和/或，促进组蛋白甲基转移酶ccla、组蛋白去乙酰化酶hdaa、全局调控因子laea和/或全局调控因子vea的表达。

28、在一种优选的实施方式中，所述促进非靶向调控基因的表达是指基因工程菌与野生型的出发菌株相比，所述目的基因的表达量或活性要高于野生型的出发菌株。在一个实施方式中，上述过表达可以通过引入表达载体来过表达目的基因来实现；其他的实施方式中，上述过表达也可以通过在出发菌株中引入额外的目的基因的拷贝、通过增加目的基因的拷贝数来实现；其他的实施方式中，还可以通过对目的基因的启动子优化来实现，比如，通过将目的基因的原始启动子替换为启动子活性更高的启动子来实现目的基因的过表达。

29、另一方面，本技术还提供了一种所述方法改造获得的工程菌。

30、优选的，所述工程菌为鞘茎点霉属真菌(coleophoma sp.)。

31、另一方面，本技术还提供了所述方法或所述的工程菌在米卡芬净前体fr901379合成中的应用。

32、另一方面，本技术还提供了一种合成米卡芬净前体fr901379的方法，所述方法包括：利用所述工程菌发酵获得fr901379。

33、优选的，所述方法包括对所述工程菌株进行培养的步骤。

34、其中，可采用通用的发酵方法进行的发酵或培养，以制备获得fr901379。

35、另一方面，本技术还提供了采用所述方法制备获得的米卡芬净前体fr901379。

36、另一方面，本技术还提供了非靶向调控基因或所述方法或所述的工程菌在制备米卡芬净中的应用，其特征在于，所述非靶向调控基因选自表观遗传修饰因子、全局调控因子、cop9信号复合体亚基中的一种或多种。

37、在一种优选的实施方式中，所述非靶向调控基因或所述方法或所述的工程菌在制备米卡芬净中的应用包括：利用所述工程菌发酵获得fr901379，再利用fr901379制备米卡芬净。

38、本发明具有如下有益效果：

39、本发明针对fr901379工程菌进行非靶向扰动策略来快速锁定与生产性状相关的代谢及调控模块，进而研究与鞘茎点霉发酵性能相关的关键基因，对提高fr901379产量具有重要的研究价值。

40、本发明通过敲除或过表达表观遗传修饰因子(组蛋白甲基转移酶ccla、去乙酰化酶hdaa)，全局调控因子(laea、vea、velb)，以及调控cop9信号复合体csne亚基对fr901379工程菌代谢网络产生非靶向扰动，获得fr901379产量不同的突变菌株集，为fr901379合成发酵提供了新的工程菌株和改造思路。