一种促再生基因及其引物、蛋白、融合蛋白以及其在提高辣椒基因编辑效率中的应用

本发明属于植物分子生物学，尤其涉及一种促再生基因及其引物、蛋白、融合蛋白以及其在提高辣椒基因编辑效率中的应用。

背景技术：

1、促再生基因在植物的生长和再生过程中起着重要作用，这些基因的作用涉及到植物细胞分裂、分化和组织再生等方方面面。促再生基因的表达与改善愈伤组织形成或植物再生有关，利用这些基因可显著提高植物再生及基因编辑的效率。

2、生长调节因子(grfs)是一类转录因子，在植物生长发育过程中起着重要的调节作用，如诱导茎的伸长、调控叶原基的细胞增殖、参与花器官发生、器官再生、光合作用效率以及控制谷物大小和产量。重要的是，grf基因被认为是一类knox(knotted1-样同源框)基因的上游调节因子，这些基因对于维持适当的sam活性水平以及其他knox i表达的调节因子都是必需的，这一功能在单子叶植物和双子叶植物中都得到了保守。grf-gif融合蛋白可以改变植物转化和基因编辑，现今在其他种类植物上已经有所研究，如小麦grf4-gif1融合蛋白的转基因表达显着提高了单子叶水稻和小麦的基因编辑效率，也可以提高双子叶植物柑橘的基因编辑效率；共表达grf5促进生菜的基因编辑效率。

3、从以上已有研究看，对促再生基因grfs的功能研究分析及对转基因植物的影响很多，而目前，对于辣椒的促再生基因grfs的研究尚且还不清晰。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是辣椒的促再生基因grfs的研究尚且空缺，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种促再生基因及其引物、蛋白、融合蛋白以及其在提高辣椒基因编辑效率中的应用。

2、为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

3、一种促再生基因cagrf，其核苷酸序列如seq id no.1-3中任一项所示。

4、在同一个技术构思下，本发明还提供一种cagrf蛋白，其氨基酸序列如seq idno.4-6中任一项所示。

5、在同一个技术构思下，本发明还提供一种促再生基因caerf，其核苷酸序列如seqid no7-9中任一项所示。

6、在同一个技术构思下，本发明还提供一种caerf蛋白，其氨基酸序列如seq idno.10-12中任一项所示。

7、在同一个技术构思下，本发明还提供一种融合蛋白，其包括所述的cagrf蛋白中的至少一种和权利要求4所述的caerf蛋白中的至少一种。

8、更优选的，所述融合蛋白为cagrf4-caerf1a。

9、本申请通过同源比对分析后构建了cagrf4-caerf1a，其转化率是普通pkse401的4倍，能显著促进不定芽再生，提高转化编辑效率。

10、在同一个技术构思下，本发明还提供一种所述促再生基因cagrf、cagrf蛋白、促再生基因caerf或所述的caerf蛋白在提高辣椒基因编辑效率中的应用。

11、优选的，所述提高辣椒基因编辑效率的方法包括如下步骤：

12、(1)构建促再生基因cagrf或/和促再生基因caerf的表达载体，将表达载体转入农杆菌细胞，得到菌液；

13、(2)将所述菌液接种到培养基上，收集培养物，利用所述培养物浸泡待编辑辣椒子叶外植体，进行共培养，诱导培养，即得到辣椒基因编辑植株。

14、优选的，所述表达载体以pkse401为骨架，所述表达载体中包含再生基因caerf和cagrf。

15、优选的，所述共培养采用的培养基的配方包括：ms培养基，zt1.6-2.4mg/l，iaa0.08-0.12mg/l，mes1-1.5um，ph5.8-6.0，所述诱导培养采用的培养基包括芽诱导培养基cim、伸长诱导培养基sim和生根诱导培养基gim，其中，芽诱导培养基cim配方包括：ms培养基，糖24-36g/l，琼脂6-10g/l，tdz0.6-1.0mg/l，ph5.8-6.0，伸长诱导培养基sim配方包括：ms培养基，糖24-36g/l，琼脂6-10g/l，0.3-0.5mg/ltdz，0.8-1.2mg/l aba，4-6mg/lga3，5-10mg/l agno3，ph5.8-6.0，生根诱导培养基gim配方包括：1/2ms培养基，糖24-36g/l，琼脂6-10g/l，0.15-0.25mg/l iaa，ph5.8-6.0。

16、在同一个技术构思下，本发明还提供一种融合蛋白的扩增引物，其核苷酸序列为seq idno.28-42。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

18、(1)本发明提供促再生基因cagrf、促再生基因caerf、cagrf蛋白、caerf蛋白，cagrf基因家族成员中cagrf1、cagrf4、cagrf5及caerf基因家族成员中caerf1a、caerf107、caerf4这六个基因对辣椒再生有促进作用；并进一步在此基础上提供erf-grf的融合蛋白，erf-grf融合蛋白能有效实现提高辣椒基因编辑效率，并且提供相关的扩增引物组合，以实现基因编辑。

19、(2)本发明提供利用促再生基因提高辣椒基因编辑效率的方法，该方法能够增强辣椒的基因编辑效率，对于辣椒基因编辑的研究和应用都具备很高的价值。

20、(3)本发明利用促再生基因编码得到的融合蛋白对待编辑辣椒子叶外植体处理后，辣椒子叶外植体的基因编辑率不低于65％，大大提高了辣椒的基因编辑效率。

技术特征：

1.一种促再生基因cagrf，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1-3中任一项所示。

2.一种促再生基因cagrf的扩增引物，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.19-20、seq id no.21-22或seq id no.23-24三组扩增引物中的任一组所示。

3.一种cagrf蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.4-6中任一项所示。

4.一种促再生基因caerf，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no7-9中任一项所示。

5.一种促再生基因caerf的扩增引物，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.13-14、seq id no.15-16或seq id no.17-18三组扩增引物中的任一组所示。

6.一种caerf蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.10-12中任一项所示。

7.一种融合蛋白，其特征在于，其包括权利要求3中所述的cagrf蛋白中的至少一种和权利要求6所述的caerf蛋白中的至少一种。

8.一种如权利要求1所述的促再生基因cagrf、权利要求3所述的cagrf蛋白、权利要求4所述的促再生基因caerf、权利要求6所述的caerf蛋白或权利要求7所述的融合蛋白在提高辣椒基因编辑效率中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述提高辣椒基因编辑效率的方法包括如下步骤：

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述表达载体以pkse401为骨架，所述表达载体中包含再生基因caerf和cagrf。

11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述共培养采用的培养基的配方包括：ms培养基，zt1.6-2.4mg/l，iaa0.08-0.12mg/l，mes1-1.5um，ph5.8-6.0。

12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述诱导培养采用的培养基包括芽诱导培养基cim、伸长诱导培养基sim和生根诱导培养基gim，其中，芽诱导培养基cim配方包括：ms培养基，糖24-36g/l，琼脂6-10g/l，tdz0.6-1.0mg/l，ph5.8-6.0，伸长诱导培养基sim配方包括：ms培养基，糖24-36g/l，琼脂6-10g/l，0.3-0.5mg/ltdz，0.8-1.2mg/laba，4-6mg/lga3，5-10mg/l agno3，ph5.8-6.0，生根诱导培养基gim配方包括：1/2ms培养基，糖24-36g/l，琼脂6-10g/l，0.15-0.25mg/l iaa，ph5.8-6.0。

技术总结本发明属于植物分子生物学技术领域，公开了再生基因CaGRF、促再生基因CaERF、CaGRF蛋白、CaERF蛋白，CaGRF基因家族成员中CaGRF1、CaGRF4、CaGRF5及CaERF基因家族成员中CaERF1A、CaERF107、CaERF4这六个基因对辣椒再生有促进作用；并进一步在此基础上提供ERF‑GRF的融合蛋白，ERF‑GRF融合蛋白能有效实现提高辣椒基因编辑效率，并且提供相关的扩增引物组合，以实现基因编辑，对于辣椒基因编辑的研究和应用都具备很高的价值。技术研发人员：胡博文,李青,许晴,张宏冠,王志权,赵红杰,龙鲲,邹学校受保护的技术使用者：湖南农业大学技术研发日：技术公布日：2024/11/18