一种免洗的蛋白标志物免疫PCR检测方法

本发明涉及蛋白质分子检测，具体涉及一种免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法。

背景技术：

1、血浆低丰度蛋白标志物通常是指浓度在fg/ml范围的蛋白，常常反映疾病的早期状态，检测血浆中的低丰度蛋白标志物对于疾病的早发现早治疗早干预至关重要。但是血浆中含有大量的其他蛋白比如白蛋白、免疫球蛋白等，这些高丰度蛋白往往会掩盖低丰度蛋白的信号，使得低丰度蛋白标志物检测困难。因此，如何检测血浆中的低丰度蛋白标志物是一大难题。

2、现有的免疫pcr技术是将pcr和免疫学原理相结合，利用抗体将蛋白质信息转化为核酸信息，然后进行pcr扩增。其原理如下：首先是将样本中的蛋白质靶标与抗体中预先结合，抗体一端连接有dna标签，与抗原一起孵育后形成抗原-抗体-dna复合物；然后通过磁珠或者微孔板将复合物分离出来，通过洗涤步骤可以去除未结合的抗体和其他非特异性结合的物质，确保只有特异性的抗原-抗体-dna复合物被保留；经过处理后，dna标签从复合物中释放出来，释放出来的dna标签作为pcr的初始dna模板进行指数扩增。加入染料或用探针法可以，实现对蛋白质的实时超灵敏检测。

3、传统的蛋白检测方法，比如elisa、western blotting、化学发光技术等，其灵敏度较低，难以满足血浆中低丰度蛋白标志物的检测需求。灵敏度较高的免疫pcr技术，将抗原抗体反应与pcr的原理相结合，检测灵敏度约为传统检测方法的1000倍，可检测低至fg/ml级别的蛋白，满足血浆低丰度蛋白标志物的检测需求。尽管免疫pcr技术具有诸多优点，比如灵敏度高、特异性强、定量检测等，但是依旧存在以下问题：

4、(1)样本损失：洗涤过程可能会导致部分结合抗原的抗体发生分离，如果洗涤强度过大或者过于频繁，将导致样本损失，影响结果准确性；

5、(2)增加时间成本：洗涤步骤可能涉及离心分离等操作，会延长反应时间，不利于快速得到检测结果；

6、(3)增加反应成本：洗涤步骤会增大试剂使用或损耗，尤其是昂贵的抗体，另外需要磁珠进行分离，也增大了成本；

7、(4)增大实验误差：免疫pcr对洗涤的要求很高，洗涤次数，洗涤条件都需要进行探索，洗涤效果不一，洗涤不彻底则会导致非特异信号残留，影响后续pcr扩增。

8、基于此，本发明设计了一种高灵敏、免洗的方法以实现血浆中低丰度蛋白标志物的检测。

技术实现思路

1、针对现有技术所存在的上述缺点，本发明提供了一种免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

3、一种免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，设计一种桥梁探针s probe，其可以与发生变构的双链适体探针apt-aprobe中的输入探针aprobe的3’杂交互补；所述双链适体探针被设计为3’封闭的结构，apt链作为封闭链封闭aprobe，形成apt-aprobe，当其与蛋白靶标结合后会发生变构，使输入探针aprobe与apt链分离并暴露出3’的区域，从而为桥梁探针s probe提供互补区域；当输入探针aprobe和桥梁探针s probe发生互补后，t4 dna聚合酶发挥其5’→3’的聚合酶活性，将输入探针aprobe和桥梁探针s probe延伸形成稳定的双链体；当不存在蛋白靶标时，游离的桥梁探针s probe被t4 dna聚合酶的外切酶活性剪切，不会产生荧光信号；

4、具体检测步骤为：

5、步骤一：将双链适体探针apt-aprobe与蛋白在室温摇床上孵育，使得适体apt充分与蛋白结合；

6、步骤二：加入桥梁探针s probe和t4 dna聚合酶，进行聚合剪切反应；

7、步骤三：接着对步骤二的反应产物进行pcr扩增；在pcr扩增体系中加入荧光染料，通过监测荧光信号的变化来实时监测pcr反应中dna的扩增情况。

8、更进一步的，步骤三中，25ml的12％的page胶体系为：10ml去离子水，9.8ml的30％的聚丙烯酰胺，5ml的5×tbe buffer，180ul的10％aps溶液，16ul的temed溶液；电泳分离条件为：1×tbe buffer，电压110v，时间50min。

9、更进一步的，步骤三中，在pcr扩增体系中加入sybr green i，当dna双链被复制时，sybr green i染料会结合到新形成的双链dna分子上，导致荧光信号的增强；随着循环次数的增加，有更多的双链dna被产生，荧光信号的强度也相应增加；荧光信号的增加与双链dna的数量成正比，通过监测荧光信号的变化来实时监测pcr反应中dna的扩增情况。

10、更进一步的，步骤四中，pcr程序为：95℃反应5min，(95℃，15s；60℃，30s)×45cycles。

11、更进一步的，15ul的pcr扩增体系为：5.4ul无酶水，0.3ul上游引物，上游引物浓度为20um，0.3ul下游引物，下游引物浓度为20um，7.5ul的2×sybr green mix溶液，1.5ul的t4 dna聚合酶的反应产物。

12、更进一步的，t4 dna聚合酶反应的dntp浓度为100nm。

13、更进一步的，桥梁探针s probe与输入探针aprobe的互补碱基个数为12个。

14、更进一步的，t4 dna聚合酶的反应温度为12℃。

15、更进一步的，t4 dna聚合酶的反应时间为40min。

16、更进一步的，t4 dna聚合酶的酶浓度为0.12u。

17、本发明相较于现有技术，其有益效果为：

18、(1)改进了现有的免疫pcr技术，无需洗涤步骤即可实现低丰度蛋白标志物的检测；减少了洗涤步骤，降低了实验时间，简化了实验操作流程，避免了多次洗涤造成的样品损失，提高了实验效率；

19、(2)同时还降低了人为操作的失误，封闭体系中进行操作减少了外部环境对样本的污染，提高了结果的准确性和稳定性；并且，由于无需洗涤，也节省了洗涤液、磁珠、离心管的消耗，降低了反应成本；

20、(3)减少了繁琐的洗涤步骤，提高了效率并降低了实验误差。

技术特征：

1.一种免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，设计一种桥梁探针sprobe，其可以与发生变构的双链适体探针apt-aprobe中的输入探针aprobe的3’杂交互补；所述双链适体探针被设计为3’封闭的结构，apt链作为封闭链封闭aprobe，形成apt-aprobe，当其与蛋白靶标结合后会发生变构，使输入探针aprobe与apt链分离并暴露出3’的区域，从而为桥梁探针s probe提供互补区域；当输入探针aprobe和桥梁探针s probe发生互补后，t4dna聚合酶发挥其5’→3’的聚合酶活性，将输入探针aprobe和桥梁探针s probe延伸形成稳定的双链体；当不存在蛋白靶标时，游离的桥梁探针s probe被t4 dna聚合酶的外切酶活性剪切，不会产生荧光信号；

2.根据权利要求1所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，步骤三中，25ml的12％的page胶体系为：10ml去离子水，9.8ml的30％的聚丙烯酰胺，5ml的5×tbebuffer，180ul的10％aps溶液，16ul的temed溶液；电泳分离条件为：1×tbe buffer，电压110v，时间50min。

3.根据权利要求1所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，步骤三中，在pcr扩增体系中加入sybr green i，当dna双链被复制时，sybr green i染料会结合到新形成的双链dna分子上，导致荧光信号的增强；随着循环次数的增加，有更多的双链dna被产生，荧光信号的强度也相应增加；荧光信号的增加与双链dna的数量成正比，通过监测荧光信号的变化来实时监测pcr反应中dna的扩增情况。

4.根据权利要求3所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，步骤四中，pcr程序为：95℃反应5min，(95℃，15s；60℃，30s)×45cycles。

5.根据权利要求4所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，15ul的pcr扩增体系为：5.4ul无酶水，0.3ul上游引物，上游引物浓度为20um，0.3ul下游引物，下游引物浓度为20um，7.5ul的2×sybr green mix溶液，1.5ul的t4 dna聚合酶的反应产物。

6.根据权利要求5所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，t4 dna聚合酶反应的dntp浓度为100nm。

7.根据权利要求6所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，桥梁探针sprobe与输入探针aprobe的互补碱基个数为12个。

8.根据权利要求7所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，t4 dna聚合酶的反应温度为12℃。

9.根据权利要求8所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，t4 dna聚合酶的反应时间为40min。

10.根据权利要求9所述的免洗的蛋白标志物免疫pcr检测方法，其特征在于，t4dna聚合酶的酶浓度为0.12u。

技术总结本发明公开了一种免洗的蛋白标志物免疫PCR检测方法，属于蛋白质分子检测技术领域，设计一种桥梁探针S probe，其可以与发生变构的双链适体探针apt‑Aprobe中的输入探针Aprobe的3’杂交互补；所述双链适体探针被设计为3’封闭的结构，apt链作为封闭链封闭Aprobe，形成apt‑Aprobe，当其与蛋白靶标结合后会发生变构，使输入探针Aprobe与apt链分离并暴露出3’的区域，从而为桥梁探针S probe提供互补区域；当输入探针Aprobe和桥梁探针S probe发生互补后，T4DNA聚合酶发挥其5’→3’的聚合酶活性，将输入探针Aprobe和桥梁探针S probe延伸形成稳定的双链体。本发明引入具有聚合及剪切作用的T4DNA聚合酶，其可以聚合与输入探针杂交的桥梁探针，水解掉游离的桥梁探针，从而无需洗涤即可实现阳性和阴性的区分。技术研发人员：程伟,广玉洁,杨甜甜,汤漫受保护的技术使用者：重庆医科大学技术研发日：技术公布日：2024/11/14