用于将免疫抑制信号转化为共刺激信号的嵌合开关受体的制作方法

本公开一般地涉及嵌合多肽、包含其的经工程化的免疫细胞(例如t细胞)、编码其的多核苷酸以及经工程化的免疫细胞在治疗应用中的用途。

背景技术：

1、经基因修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的免疫细胞的过继转移显示出有望作为治疗癌症的新方法(参见例如，brenner等人,《免疫学新见(current opinion inimmunology)》,22(2):251-257(2010)；rosenberg等人,《自然综述：癌症(nature reviewscancer)》,8(4):299-308(2008))。免疫细胞可以被基因修饰以表达嵌合抗原受体(car)，即包含抗原识别部分和t细胞活化结构域的融合蛋白(参见例如，eshhar等人,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》,90(2):720-724(1993))。含有car的免疫细胞，例如car-t细胞(car-t)被工程化以赋予其抗原特异性，同时保持或增强其识别和杀伤靶细胞的能力。

2、car-t细胞疗法的改进，例如提高治疗的效率和/或准确率，将使患者群体受益。

技术实现思路

1、本文尤其提供了嵌合多肽，特别是嵌合开关受体，其是融合蛋白，包含与源自一种或多种共刺激蛋白(例如，cd2、cd28、myd88、dap10或icos)的跨膜结构域和/或胞内信号传导结构域融合的源自抑制性受体(例如，pd1或tgfbr2(tgfβ受体ii))的胞外域和/或跨膜结构域。

2、嵌合开关受体可以通过破坏免疫抑制并增强效力被利用在基于细胞的免疫疗法(例如，car t疗法)中。嵌合开关受体的益处是多方面的。首先，胞外域可以用作诱饵/显性负性受体(dominant negative receptor)，其保护car t细胞免受免疫抑制(例如，pd1配体pdl1或tgfb)。其次，胞内信号传导结构域提供另外的共刺激信号，其可以增强car t细胞活性和效力。第三，通过嵌合开关受体的信号传导在存在胞外域配体的情况下被活化。因此，它可以优先在最需要增强效力的抑制性肿瘤微环境(例如，胞外域配体丰富的地方)中被打开，并在其他地方(例如，在很少或没有胞外域配体的环境中)被关小或关闭以维持足够的安全性。在某些实施方案中，包含或表达本文所公开的嵌合多肽的经工程化的免疫细胞克服了免疫抑制性肿瘤微环境，显示出增强的活性，同时分泌可接受水平的细胞因子并达到足够或改善的安全性。

3、本文还提供了编码所公开的嵌合开关受体的多核苷酸和载体、包含和/或表达所公开的嵌合开关受体和/或编码其的多核苷酸和载体的细胞(例如，经工程化的免疫细胞，诸如经工程化的t细胞)、此类细胞的群体、包含此类细胞和细胞群的组合物、包括施用本文所公开的细胞和细胞群的治疗病症(例如癌症)的方法、工程化此类细胞的方法以及通过此类方法制备的细胞。

4、在一方面，本公开提供了一种编码包含胞外结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的嵌合多肽的多核苷酸，其中胞外结构域包含抑制性蛋白的胞外结构域。在一些实施方案中，抑制性蛋白是抑制性受体。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含pd-1(程序性细胞死亡蛋白-1)胞外结构域。在一些实施方案中，pd-1胞外结构域包含野生型hpd-1(人pd-1)胞外结构域的氨基酸序列(例如seq id no:9的氨基酸序列)。在一些实施方案中，pd-1胞外结构域包含野生型hpd-1胞外结构域的变体的氨基酸序列(例如，seq id no:9的变体的氨基酸序列，诸如与seq id no:9具有至少90％同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，pd-1胞外结构域变体相对于野生型pd-1胞外结构域(例如，相对于seq id no:9)包含一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的pd-1胞外结构域变体包含高亲和力(“ha”)hpd-1胞外结构域的氨基酸序列(例如，示例性ha hpd-1胞外结构域包含或具有seq id no:10的氨基酸序列；关于ha hpd-1蛋白，参见，例如，r.l.maute等人,proc natl acad sci u s a.2015年；112(47):e6506-e6514.doi:10.1073/pnas.1519623112)。

5、在本文所公开的多肽和经编码的多肽的一些实施方案中，其中第二氨基酸序列与第一氨基酸序列具有至少90％相同，第二氨基酸序列中的一个或多个(例如，全部或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸与第一氨基酸序列中的对应氨基酸不同，例如氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。

6、在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含tgfβ受体(例如，tgfbr2)胞外结构域。在一些实施方案中，tgfβ受体胞外结构域包含野生型htgfb受体胞外结构域的氨基酸序列(例如，seq id no:12的氨基酸序列)。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含tgfβ受体(例如，tgfbr2)胞外结构域的变体。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含seq id no:12的氨基酸序列的变体，例如与seq idno:12的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，胞外结构域包含htgfb受体胞外结构域变体，该变体相对于野生型htgfb受体胞外结构域(例如，相对于seq id no:12)包含一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代。在一些实施方案中，该变体包含从成熟野生型htgfb受体的n末端的25个氨基酸缺失并且包含seq id no:13的氨基酸序列。

7、在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含特异性地识别并且结合至抑制性配体(例如，抑制性配体，诸如pdl1或tgfβ或者一种或多于一种特异性tgfβ同种型)的抗体或抗体的抗原结合部分。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含特异性地识别并且结合至抑制性配体(诸如pdl1或tgfβ或者一种或多种tgfβ同种型，例如选自tgfβ1、tgfβ2或tgfβ3的tgfβ同种型)的单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含抗pdl1 scfv。在一些实施方案中，抗pdl1 scfv可以包含例如阿维单抗、德瓦鲁单抗或阿特朱单抗的抗原结合结构域。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含抗tgfβscfv。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞外结构域包含抗tgfβscfv，该抗tgfβscfv仅与一种tgfβ同种型(诸如选自tgfβ1、tgfβ2或tgfβ3的tgfβ同种型)结合并识别，例如仅与tgfβ1结合并识别的抗tgfβscfv。在一些实施方案中，抗tgfb scfv可以包含非苏木单抗或sar438459的抗原结合结构域。抗tgfβ同种型抗体(例如，抗tgfβ同种型scfv)及制备其的方法在例如us20190071493中公开，该专利以引用的方式整体并入本文。

8、在一些实施方案中，经编码的多肽包含一个或仅一个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，经编码的多肽包含多于一个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，经编码的多肽包含多于一个胞内信号传导结构域，所有这些结构域彼此相同。在一些实施方案中，经编码的多肽包含多于一个胞内信号传导结构域，所有这些结构域彼此不同。在一些实施方案中，经编码的多肽包含多于一个胞内信号传导结构域，这些结构域中的一些彼此相同并且这些结构域中的一些与其他不同。在一些实施方案中，经编码的多肽包含两个、三个、四个、五个或六个胞内信号传导结构域，所有这些结构域彼此相同，这些结构域彼此都不相同，或这些结构域中的一些彼此相同。

9、在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的一个或多个胞内结构域包含一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：cd28胞内信号传导结构域、cd2胞内信号传导结构域、myd88胞内信号传导结构域、icos胞内信号传导结构域、dap10胞内信号传导结构域、ox40胞内信号传导结构域、baffr胞内信号传导结构域和cd40胞内信号传导结构域、其任何变体及其任何组合。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含cd28胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含cd2胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含myd88胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含icos胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含dap10胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含ox40胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含baffr胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含cd40胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含cd28、cd2、myd88、icos、dap10、ox40、baffr和cd40胞内信号传导结构域的任何组合。

10、在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的一个或多个胞内结构域包含seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:15、seq idno:29、seq id no:27、seq id no:33、seq id no:31和seq id no:35(在表1中示出)中的任一者或多于一者的氨基酸序列或氨基酸序列的两个或更多个拷贝。对应的多核苷酸序列在表2中示出。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的一个或多个胞内结构域包含seq idno:15、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:23、seq id no:24、seq idno:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33和seq id no:35(如表1中所示)(例如，其中的任两个、任三个、任四个或任五个，或其中的任两个、任三个、任四个或任五个的多个拷贝)的氨基酸序列的任何组合。对应的多核苷酸序列在表2中示出。

11、在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的跨膜结构域包括cd28跨膜结构域、cd2跨膜结构域、pd-1跨膜结构域、icos跨膜结构域、dap10跨膜结构域、ox40跨膜结构域、baffr跨膜结构域或cd40跨膜结构域。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的跨膜结构域包含seqid no:14、seq id no:17、seq id no:22、seq id no:26、seq id no:28、seq idno:30、seqid no:32或seq id no:34(在表1中示出)的氨基酸序列。对应的多核苷酸序列在表2中示出。

12、在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽或嵌合开关受体的胞内结构域包含cd28或cd2胞内结构域或其变体。在一些实施方案中，胞内结构域包含seq id no:19、seq id no:20或seq id no:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含变体cd28或变体cd2胞内结构域，并且包含或表达嵌合多肽的经工程化的免疫细胞在嵌合多肽的胞外结构域与其配体结合后表达或分泌降低水平的细胞因子。在一些实施方案中，胞内结构域包含变体cd28或变体cd2胞内结构域，并且细胞因子的降低水平比由包含或表达含有对应野生型胞内结构域的嵌合多肽的经工程化的免疫细胞分泌的细胞因子的水平低约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍和5倍。在某些实施方案中，胞外结构域包含pd1或tgfb受体胞外结构域。在一些实施方案中，细胞因子是gm-csf、infg、tnfa或il2。在一些实施方案中，本公开的包含或表达嵌合多肽的经工程化的免疫细胞分泌降低水平的细胞因子并且当用于过继性细胞疗法时表现出改善的安全性。在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞是car t细胞。

13、在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞内结构域包含cd2胞内结构域或其变体。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞内结构域包含cd2胞内结构域或其变体，并且经编码的嵌合多肽的跨膜结构域包含cd2跨膜结构域。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞内结构域包含具有seq id no:23的氨基酸序列的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞内结构域包含与seq id no:23的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

14、在本文所公开的编码包含胞外结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的嵌合多肽的多核苷酸的一些实施方案中，胞内结构域包含截短的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，截短的cd2胞内结构域包含seq id no:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，截短的cd2胞内结构域包含与seq id no:24的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

15、在本文所公开的多核苷酸的一些实施方案中，经编码的跨膜结构域包含cd2跨膜结构域。在一些实施方案中，cd2跨膜结构域包含seq id no:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd2跨膜结构域包含与seq id no:22的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

16、在本文所公开的多核苷酸的一些实施方案中，经编码的多肽包含信号肽。在一些实施方案中，经编码的多肽包含cd8α信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含seq id no:2的氨基酸序列。

17、在本文所公开的编码包含胞外结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的嵌合多肽的多核苷酸的一些实施方案中，多肽进一步包含位于胞外结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域包含seq id no:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含与seq id no:36的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

18、在本文所公开的编码包含胞外结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的嵌合多肽(例如嵌合开关受体)的多核苷酸的一些实施方案中，多核苷酸包含seq id no:118-158(在表4中示出)中的任一者的核酸序列，并且多肽包含seq id no:75-115(在表3中示出)中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含与seq id no:75-115中的任一者的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经编码的多肽是pd1嵌合开关受体并且包含seq id no:75-94中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，经编码的多肽包含与seq id no:75-94中的任一者的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经编码的多肽是tgf-βr2(tgfbr2或br2)嵌合开关受体并且包含seq id no:95-115中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，经编码的多肽包含与seq id no:95-115中的任一者的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，经编码的多肽进一步包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含seq idno:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含seq id no:2的氨基酸序列。

19、在本文所公开的编码包含胞外结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的嵌合多肽的多核苷酸的一些实施方案中，嵌合多肽是第一多肽，并且多核苷酸进一步编码第二多肽。在一些实施方案中，第二多肽包含或是嵌合细胞因子受体(ccr)。在一些实施方案中，ccr具有组成型活性。在一些实施方案中，ccr是诱导型的。在一些实施方案中，第二多肽包含或是嵌合抗原受体(car)。

20、在另一方面，本公开提供了一种包含本文所公开的多核苷酸的载体，例如，编码包含胞外结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的嵌合多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或腺病毒载体。

21、在另一方面，本公开提供了一种由本文所公开的多核苷酸编码的嵌合多肽。在又一方面，本公开提供了一种由本文所公开的载体编码的嵌合多肽。

22、在另一方面，本公开提供了一种包含胞外结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的嵌合多肽，其中胞外结构域包含抑制性蛋白的胞外结构域，诸如抑制性受体，例如抑制性跨膜受体的胞外结构域。在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含pd-1胞外结构域。在一些实施方案中，pd-1胞外结构域包含野生型hpd-1胞外结构域的氨基酸序列(例如seq id no:9的氨基酸序列)。在一些实施方案中，pd-1胞外结构域包含野生型hpd-1胞外结构域的变体的氨基酸序列(例如，seq id no:9的变体的氨基酸序列，诸如与seq idno:9具有至少90％同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，pd-1胞外结构域变体相对于野生型pd-1胞外结构域(例如，相对于seq id no:9)包含一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代。在一些实施方案中，嵌合多肽的pd-1胞外结构域变体包含高亲和力(“ha”)hpd-1胞外结构域的氨基酸序列(例如，包含或具有seq id no:10的氨基酸序列)。

23、在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含tgfβ受体(例如，tgfbr2)胞外结构域。在一些实施方案中，tgfβ受体胞外结构域包含野生型htgfb受体胞外结构域的氨基酸序列(例如，seq id no:12的氨基酸序列)。在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含tgfβ受体(例如，tgfbr2)胞外结构域的变体。在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含seq id no:12的氨基酸序列的变体，例如与seq id no:12的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，胞外结构域包含htgfb受体胞外结构域变体，该变体相对于野生型htgfb受体胞外结构域(例如，相对于seq id no:12)包含一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代。在一些实施方案中，该变体包含25个氨基酸缺失并且包含seq idno:13的氨基酸序列(tgfβr2 ecdδn25，在本文中也称为tgfβr2 ecd dn25)。

24、在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含特异性地识别并且结合至抑制性配体(诸如pdl1或tgfβ或者一种或多于一种特异性tgfβ同种型)的抗体或抗体的抗原结合部分。在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含特异性地识别并且结合至抑制性配体(诸如pdl1或tgfβ或者一种或多种tgfβ同种型，例如选自tgfβ1、tgfβ2或tgfβ3的tgfβ同种型)的单链可变片段(scfv)。在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含抗pdl1scfv。在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含抗tgfβscfv。在一些实施方案中，嵌合多肽的胞外结构域包含抗tgfβscfv，该抗tgfβscfv仅与一种tgfβ同种型(诸如选自tgfβ1、tgfβ2或tgfβ3的tgfβ同种型)结合并识别，例如仅与tgfβ1结合并识别的抗tgfβscfv。抗tgfβ同种型抗体(例如，抗tgfβ同种型scfv)及制备其的方法在例如us20190071493中公开，该专利以引用的方式整体并入本文。

25、在一些实施方案中，本文所提供的嵌合多肽包含一个或仅一个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合多肽包含多于一个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合多肽包含多于一个胞内信号传导结构域，所有这些结构域彼此相同。在一些实施方案中，嵌合多肽包含多于一个胞内信号传导结构域，所有这些结构域彼此不同。在一些实施方案中，嵌合多肽包含多于一个胞内信号传导结构域，这些结构域中的一些彼此相同并且这些结构域中的一些与其他不同。在一些实施方案中，嵌合多肽包含两个、三个、四个、五个或六个胞内信号传导结构域，所有这些结构域彼此相同，这些结构域彼此都不相同，或这些结构域中的一些彼此相同。

26、在一些实施方案中，本文所提供的嵌合多肽的一个或多个胞内结构域包含一个或多个胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：cd28胞内信号传导结构域、cd2胞内信号传导结构域、myd88胞内信号传导结构域、icos胞内信号传导结构域、dap10胞内信号传导结构域、ox40胞内信号传导结构域、baffr胞内信号传导结构域和cd40胞内信号传导结构域及其任何组合。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含cd28胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含cd2胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含myd88胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含icos胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含dap10胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含ox40胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含baffr胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含cd40胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含cd28、cd2、myd88、icos、dap10、ox40、baffr和cd40胞内信号传导结构域的任何组合。

27、在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽的一个或多个胞内结构域包含seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:15、seq idno:29、seq id no:27、seq id no:33、seq id no:31和seq id no:35中的任一者或多于一者的氨基酸序列或氨基酸序列的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽的一个或多个胞内结构域包含seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:15、seq id no:29、seq id no:27、seq id no:33、seq idno:31和seq id no:35(例如，其中的任两个、任三个、任四个或任五个，或其中的任两个、任三个、任四个或任五个的多个拷贝)的氨基酸序列的任何组合。

28、在一些实施方案中，胞内结构域包含cd2胞内结构域或其变体。在一些实施方案中，胞内结构域包含变体cd2胞内结构域，其中胞内结构域包含至少一个sh3结构域和/或至少一个gyf结合结构域，并且任选地变体cd2胞内结构域是截短的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，sh3结构域包含seq id no:168或169的氨基酸序列，并且gyf结合结构域包含seqid no:176的氨基酸序列，在一些实施方案中，胞内结构域包含seq id no:170、171、172、173、174、175和176中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或全部的氨基酸序列，并且任选地变体cd2胞内结构域是截短的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含变体cd2胞内结构域，该变体cd2胞内结构域包含seq id no:170和176，并且任选地该变体cd2胞内结构域是截短的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含变体cd2胞内结构域，该变体cd2胞内结构域包含seq id no:174和175，并且任选地该变体cd2胞内结构域是截短的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含变体cd2胞内结构域，该变体cd2胞内结构域包含seq id no:170、171、173、174和175，并且任选地该变体cd2胞内结构域是截短的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含cd2胞内结构域的变体，该变体包含seq id no:170-176，并且任选地该变体cd2胞内结构域是截短的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，截短的cd2胞内结构域包含从全长cd2胞内结构域的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个氨基酸缺失，并且任选地截短的cd2胞内结构域包含一个或多个gyf结合结构域和/或一个或多个sh3结构域。在一些实施方案中，全长cd2胞内结构域包含seq id no:23的氨基酸序列。

29、在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽的胞内结构域包含cd2胞内结构域或其变体。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽的胞内结构域包含cd2胞内结构域或其变体，并且嵌合多肽的跨膜结构域包含cd2跨膜结构域。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽的胞内结构域包含具有seq id no:23的氨基酸序列的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，经编码的嵌合多肽的胞内结构域包含与seq id no:23的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

30、在本文所公开的嵌合多肽的一些实施方案中，胞外结构域包含截短的cd2胞内结构域。在一些实施方案中，截短的cd2胞内结构域包含seq id no:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，截短的cd2胞内结构域包含与seq id no:24的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

31、在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽的跨膜结构域包括cd28跨膜结构域、cd2跨膜结构域、pd-1跨膜结构域、icos跨膜结构域、dap10跨膜结构域、ox40跨膜结构域、baffr跨膜结构域或cd40跨膜结构域。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽的跨膜结构域包含seqid no:17、seq id no:22、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32或seq id no:34的氨基酸序列。

32、在一些实施方案中，跨膜结构域任选地包含相邻胞外结构域的氨基酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域任选地包含相邻胞外结构域的1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个氨基酸残基。

33、在本文所公开的嵌合多肽的一些实施方案中，跨膜结构域包含cd2跨膜结构域。在一些实施方案中，cd2跨膜结构域包含seq id no:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，cd2跨膜结构域包含与seq id no:22的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

34、在一些实施方案中，嵌合多肽包含pd1胞外结构域，该pd1胞外结构域包含与seqid no:9或seq id no:10具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含cd28跨膜结构域，该cd28跨膜结构域包含与seq id no:17具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含cd28胞内结构域，该cd28胞内结构域与seq idno:19具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，嵌合多肽包含cd2跨膜结构域，该cd2跨膜结构域包含与seq id no:22具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含cd2胞内结构域，该cd2胞内结构域包含与seq id no:24具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与seq id no:76、79、85或88具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

35、在本文所公开的嵌合多肽的一些实施方案中，嵌合多肽包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包cd8α信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含seq id no:2的氨基酸序列。

36、在本文所公开的嵌合多肽的一些实施方案中，多肽进一步包含位于胞外结构域和跨膜结构域之间的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域包含seq id no:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含与seq id no:36的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。

37、在本文所公开的嵌合多肽的一些实施方案中，嵌合多肽包含seq id no:75-115中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含与seq id no:75-115中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。

38、在另一方面，本公开提供了一种经工程化的细胞，例如包含编码本文所公开的嵌合多肽的多核苷酸的经工程化的免疫细胞。在一些实施方案中，经工程化的细胞(例如，经工程化的免疫细胞)表达经编码的嵌合多肽，例如，经工程化的免疫细胞功能性地表达经编码的嵌合多肽，例如在细胞表面上。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞功能性地表达包含信号肽的嵌合多肽，嵌合多肽的信号肽被切割，并且缺少信号肽的嵌合多肽在经工程化的免疫细胞的表面上表达。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含和/或表达没有其信号肽的嵌合多肽，例如在经工程化的免疫细胞表面上。在一些实施方案中，包含编码本文所公开的嵌合多肽的多核苷酸的经工程化的细胞(例如，经工程化的免疫细胞)不表达嵌合多肽。

39、在另一方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，其包含含有本文所公开的多核苷酸的本文所公开的载体。在一些实施方案中，经工程化的细胞(例如，经工程化的免疫细胞)表达经编码的嵌合多肽，例如，经工程化的免疫细胞功能性地表达经编码的嵌合多肽，例如在细胞表面上。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞功能性地表达包含信号肽的嵌合多肽，并且嵌合多肽的信号肽被切割，并且缺少信号肽的嵌合多肽在经工程化的免疫细胞的表面上表达。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含和/或表达没有信号肽的嵌合多肽，例如在经工程化的免疫细胞表面上。在一些实施方案中，包含编码本文所公开的嵌合多肽的多核苷酸的经工程化的细胞(例如，经工程化的免疫细胞)不表达嵌合多肽。

40、在另一方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，其包含本文所公开的嵌合多肽。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含嵌合多肽。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含缺少信号肽的嵌合多肽。

41、在另一方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，其表达本文所公开的嵌合多肽。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含嵌合多肽。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含缺少信号肽的嵌合多肽。

42、在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含或表达本公开的嵌合多肽，该嵌合多肽包含cd28或cd2胞内结构域或其变体。在一些实施方案中，胞内结构域包含seq id no:19、seq id no:20或seq id no:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含变体cd28或变体cd2胞内结构域，并且经工程化的免疫细胞在嵌合多肽的胞外结构域与其配体结合后表达或分泌降低水平的细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子的降低水平比由包含或表达含有对应野生型胞内结构域的嵌合多肽的经工程化的免疫细胞分泌的细胞因子的水平低约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍和5倍。在某些实施方案中，胞外结构域包含pd1或tgfb受体胞外结构域。在一些实施方案中，细胞因子是gm-csf、infg、tnfa或il2。在一些实施方案中，本公开的包含或表达嵌合多肽的经工程化的免疫细胞分泌降低水平的细胞因子并且当用于过继性细胞疗法时表现出可接受的或改善的安全性。在一些实施方案中，工程改造的免疫细胞是car t细胞。

43、在另一方面，本文所公开的经工程化的免疫细胞进一步包含和/或表达嵌合抗原受体(car)，其中car包含胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含编码car的多核苷酸或载体。在一些实施方案中，car胞内信号传导结构域包含cd3ζ信号传导结构域、cd28信号传导结构域和4-1bb信号传导结构域中任一种或多种的一个拷贝或多于一个拷贝。在一些实施方案中，car包含特异性地识别和/或结合至dll3的胞外配体结合结构域，例如，wo 2020/180591中描述和公开的dll3car。在一些实施方案中，car包含表3中所示的seq id no:73的氨基酸序列，其包含组分利妥昔单抗模拟表位、2g1 scfv(特异性地识别并且结合至dll3)、利妥昔单抗模拟表位、cd8α铰链、cd8α跨膜、cd8α胞质结构域(截短的)、4-1bb(tnfrsf9、cd137)胞质结构域和cd3ζ胞质结构域。在一些实施方案中，car包含以下组分：利妥昔单抗模拟表位、2g1 scfv(特异性地识别并且结合至dll3)、利妥昔单抗模拟表位、cd8α铰链、cd8α跨膜、cd8α胞质结构域(截短的)、4-1bb(tnfrsf9、cd137)胞质结构域和cd3ζ胞质结构域。在一些实施方案中，car包含由seq id no:116的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，car氨基酸序列是由seqid no:116的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，car由表4中示出的seq idno:116的核酸序列编码。

44、在另一方面，本文所公开的经工程化的免疫细胞进一步包含和/或表达嵌合细胞因子受体(ccr)。在一些实施方案中，ccr是诱导型ccr。在一些实施方案中，ccr是组成型活性ccr(caccr)。ccr在例如wo2019169290、wo2020180694、wo2020180664和wo2021041806中公开和描述，这些专利中的每一篇在此以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，ccr是在wo2019169290、wo2020180694、wo2020180664和wo2021041806中任一篇中公开和/或描述的ccr。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含编码ccr(例如，诱导型ccr或caccr)的多核苷酸或载体。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含编码ccr的多核苷酸或载体，其包含seq id no:162的氨基酸序列。在一些实施方案中，ccr进一步包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含seq id no:1的氨基酸序列。在经工程化的细胞(例如，本文所公开的经工程化的免疫细胞)的一些实施方案中，该细胞包含：编码本文所公开的嵌合多肽(例如嵌合开关受体)的第一多核苷酸或载体、编码car(例如dll3 car)的第二多核苷酸或载体和编码ccr的第三多核苷酸或载体。在经工程化的细胞(例如，本文所公开的经工程化的免疫细胞)的一些实施方案中，该细胞包含：编码本文所公开的嵌合多肽(例如嵌合开关受体)、car(例如dll3 car)和ccr中任两种的第一多核苷酸或载体、编码嵌合多肽(例如嵌合开关受体)、car(例如dll3 car)和ccr中第一多核苷酸或载体不编码的那个的第二多核苷酸或载体。在一些实施方案中，一种多核苷酸或载体编码本文所公开的嵌合多肽(例如嵌合开关受体)、car(例如dll3 car)和ccr。在一些实施方案中，经工程化的免疫细胞包含编码有或没有信号肽的dll3 car和ccr的一种或多种多核苷酸，dll3 car包含seq idno:73或165的氨基酸序列，ccr包含seq id no:162的氨基酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码有或没有信号肽的ccr和dll3 car，其包含seq id no:74的氨基酸序列。在一些实施方案中，dll3car和/或ccr进一步包含含有seq id no:1的氨基酸序列的cd8信号序列。在一些实施方案中，第一多核苷酸或载体编码如本文所公开的嵌合开关受体，并且第二多核苷酸或载体编码car(例如，dll3 car)和ccr两者并且进一步任选地编码自切割肽(例如car和ccr之间的2a肽)。例如，在一些实施方案中，第二多核苷酸或载体编码ccr-p2a-car多肽，例如，ccr-p2a-dll3 car多肽，其包含组分cd8信号序列、tpor(血小板生成素受体)(s505nw515k)、il2rb-yy、p2a、cd8信号序列、利妥昔单抗模拟表位、2g1 scfv、利妥昔单抗模拟表位、cd8α铰链、cd8α跨膜、cd8α胞质结构域(截短的)、4-1bb(tnfrsf9、cd137)胞质结构域和cd3ζ胞质结构域，例如包含seq id no:74的氨基酸序列的ccr-p2a-dll3 car多肽，其由包含seq id no:117的核酸序列的多核苷酸编码，或多肽例如包含与seq id no:74的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的dll3 car-p2a-ccr多肽。

45、在另一方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，其包含编码dll3 car和ccr的一种或多种多核苷酸，dll3 car包含seq id no:73或165的氨基酸序列，ccr包含seq idno:162的氨基酸序列。在一相关方面，本公开提供了一种经工程化的免疫细胞，其包含和/或表达dll3 car和ccr，dll3 car包含seq id no:73或165的氨基酸序列，ccr包含seq idno:162的氨基酸序列。在另一相关方面，本公开提供了一种制备经工程化的免疫细胞的方法，其中经工程化的免疫细胞包含和/或表达dll3 car和ccr，dll3 car包含seq id no:73或165的氨基酸序列，ccr包含seq id no:162的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述方法包括将细胞(例如，免疫细胞)依次或同时引入编码包含seq id no:73或165的氨基酸序列的多肽的核酸和编码包含seq id no:162的氨基酸序列的多肽的核酸中。在一些实施方案中，单个核酸(例如，载体、表达载体、逆转录病毒载体)包含编码seq id no:73或165的氨基酸序列的核酸和编码seq id no:162的氨基酸序列的核酸。在又一相关方面，本公开提供了一种使用经工程化的免疫细胞的治疗方法，其中经工程化的免疫细胞包含和/或表达dll3car和ccr，dll3 car包含seq id no:73或165的氨基酸序列，ccr包含seq id no:162的氨基酸序列。

46、在本文所公开的经工程化的免疫细胞的一些实施方案中，经工程化的免疫细胞是t细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、nk细胞、表达tcr的细胞、树突细胞或nk-t细胞。在本文所公开的经工程化的免疫细胞的一些实施方案中，细胞是自体t细胞。在本文所公开的经工程化的免疫细胞的一些实施方案中，细胞是同种异体t细胞。

47、在另一方面，本公开提供了一种包含一种或多于一种本文所公开的经工程化的免疫细胞的细胞群。在一些实施方案中，细胞群包含至少约1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109或1x1010个本文所公开的经工程化的细胞，例如经工程化的免疫细胞。在一个实施方案中，经工程化的免疫细胞群包含约1x104至约1x1010个本文所提供的经工程化的免疫细胞。

48、在另一方面，本公开提供了一种包含细胞(例如，本文所公开的经工程化的免疫细胞)的组合物。在另一方面，本公开提供了一种包含本文所公开的细胞群和药学上可接受的载剂的组合物。

49、在另一方面，本公开提供了一种治疗患者的疾病或病症的方法，所述方法包括向患者施用细胞，例如本文所公开的经工程化的免疫细胞。在另一方面，本公开提供了一种治疗患者的疾病或病症的方法，所述方法包括向患者施用本文所公开的细胞群。在另一方面，本公开提供了一种治疗患者的疾病或病症的方法，所述方法包括向患者施用本文所公开的组合物。在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，患者是非人哺乳动物。

50、在本文所公开的治疗方法的一些实施方案中，患者是人并且病症是癌症。在一些实施方案中，癌症是血液恶性肿瘤或实体癌。在一些实施方案中，所述癌症是血液恶性肿瘤，其任选地选自急性淋巴细胞性白血病(all)、急性髓样白血病(aml)、慢性髓性白血病(cml)、慢性嗜酸细胞性白血病(cel)、骨髓增生异常综合征(mds)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)和多发性骨髓瘤(mm)。在一些实施方案中，癌症是实体癌。在一些实施方案中，所述癌症是实体癌，其任选地选自胆管癌、膀胱癌、骨和软组织癌、脑瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、恶性黑素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、原发性星形细胞瘤、原发性甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、尿路上皮癌、子宫肉瘤和子宫癌。

51、在另一方面，本公开提供了一种制备本文所公开的经工程化的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将本文所公开的一种或多种多核苷酸和/或载体引入细胞(例如，免疫细胞)中的步骤。在一些实施方案中，细胞是t细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、nk细胞、表达tcr的细胞、树突细胞或nk-t细胞。在各个实施方案中，所述方法包括使用任何基因编辑技术，诸如talen、锌指、cas-clover和crispr/cas系统，和/或使用任何已知的基因敲低方法，例如采用任何各种基于rna的技术(例如，shrna、反义rna、mirna、sirna；参见，例如lam等人,mol.ther.-nucleic acids 4:e252(2015年),doi:10.1038/mtna.2015.23；sridharan和gogtay,brit.j.clin.pharmacol.82:659-72(2016年))来减少特定基因的功能表达的那些方法。在一些实施方案中，特定基因是例如pd1、trac、tgfbr、cd70、cd52、tim3、lag3、cish、cbl-b、tigit或a2ar。

52、在制备本文所公开的经工程化的免疫细胞的方法的一些实施方案中，被工程化的细胞是自体t细胞。在一些实施方案中，被工程化的细胞是同种异体t细胞。在一些实施方案中，所述方法包括或进一步包括将内源性cd70、cd52、pd1、tim3、cish、cbl-b、tigit和tcra基因中一种或多种的一个或多个基因组修饰引入细胞(例如，免疫细胞)的基因组中。在一些实施方案中，一个或多个基因组修饰完全或部分破坏和/或阻止内源性cd70、cd52、pd1、tim3、cish、cbl-b、tigit和tcra基因中一种或多种的功能表达。在制备本文所公开的经工程化的免疫细胞的方法的一些实施方案中，将多核苷酸或载体整合到免疫细胞基因组中。在一些实施方案中，载体是病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，通过随机整合将多核苷酸或载体整合到基因组中。在一些实施方案中，通过同源重组介导的位点特异性整合将多核苷酸或载体整合到基因组中。在一些实施方案中，将一种或多种多核苷酸和/或载体整合到cd70、cd52、pd1、tim3、cish、cbl-b、tigit和/或tcra基因座中。在一些实施方案中，所述方法包括将如本文所公开的第一多核苷酸或载体整合到第一遗传基因座中，并将如本文所公开的第二多核苷酸或载体整合到第二遗传基因座中。

53、在制备本文所公开的经工程化的免疫细胞的方法的一些实施方案中，所述方法包括将第一多核苷酸或载体位点特异性整合到第一遗传基因座(诸如cd70基因座、cd52基因座、pd1基因座、tim3基因座、cish基因座、tigit基因座或cbl-b基因座)中，并将第二多核苷酸或载体位点特异性整合到第二遗传基因座(诸如trac基因座)中。在一些实施方案中，第一多核苷酸或载体编码如本文所公开的包含胞外结构域、跨膜结构域和一个或多个胞内结构域的多肽，其中胞外结构域包含抑制性蛋白的胞外结构域，例如，载体编码嵌合开关受体(csr)，并且第二多核苷酸或载体编码如本文所述的car，例如如本文所述的dll3 car，并且任选地第二多核苷酸或载体进一步编码如本文所述的嵌合细胞因子受体(ccr)，例如诱导型ccr或组成型活性ccr(caccr)。在一些实施方案中，car、csr和/或ccr进一步包含信号肽。在一些实施方案中，第一多核苷酸或载体编码包含seq id no:75-115中的任一者的氨基酸序列的嵌合多肽。在一些实施方案中，第一多核苷酸或载体编码包含与seq id no:75-115中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列的嵌合多肽。

54、在各个实施方案中，制备本文所提供的经工程化的免疫细胞的方法可以应用于来自任何各种来源的细胞。所述经工程化的免疫细胞可以制备自或源自细胞，例如干细胞或来自除了将施用所述经工程化的免疫细胞的人以外的人的免疫细胞，例如除了接受者以外的供体(例如，健康志愿者)，或者可以制备自或源自细胞，例如来自将施用所述经工程化的免疫细胞的人(接受者)的干细胞或免疫细胞，或者可以源自一种或多种诱导多能干细胞(ipsc)。在各个实施方案中，免疫细胞是从健康志愿者获得的免疫细胞，是从患者获得的或源自ipsc。

55、在另一方面，本公开提供了一种通过制备本文所公开的经工程化的免疫细胞的任何方法制备的经工程化的免疫细胞。在另一方面，本公开提供了一种治疗病症(例如，如本文所述的癌症)的方法，所述方法包括例如向需要这种治疗的患者施用通过本文所公开的任何方法制备的经工程化的免疫细胞或包含通过本文所公开的任何方法制备的一个或多个经工程化的免疫细胞(例如，约105、106、107、108、109、1010、1011个经工程化的免疫细胞)的细胞群。