纳米抗体-药物加合物及其用途的制作方法

背景技术：

1、可结晶片段(fc)受体是一种免疫球蛋白受体，位于许多免疫细胞类型的细胞膜上，包含巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞。这些细胞通常仅具有有限的直接靶向抗原(如位于病毒、微生物病原体和癌细胞的表面上的抗原)的能力。然而，这些免疫细胞可以通过其表面的fc受体与多克隆抗体结合。这些多克隆抗体可以进而与位于细胞(包含细菌、寄生虫和真菌)或病毒的表面上的抗原结合，由此使免疫细胞能够作用于这些靶标。

技术实现思路

1、免疫系统包含多种特化细胞类型，其中许多特化细胞类型负责主动靶向和消除病毒、外来细胞，特别是病原性微生物(例如，细菌、寄生虫和真菌)，以及非外来的但已经经历了某些有害表型变化的细胞(例如，受损的细胞、病毒感染的细胞和转化细胞，如癌细胞)。尽管免疫细胞保护其宿主免受这些广泛的病原性细胞类型或有害细胞类型的侵害，但是这些免疫细胞通常不能直接与其靶标结合。相反，许多特化免疫细胞通过其表面上的fc受体与其宿主产生的免疫球蛋白结合，所述免疫球蛋白进而对位于靶细胞或病原体的表面上的特定抗原具有特异性。尽管此系统能够针对广泛的可能的靶标进行有效免疫，但其受限于在任何给定时间存在于宿主中的对特定抗原具有特异性的免疫球蛋白的量。对给定靶抗原具有特异性的免疫球蛋白的水平需要预先暴露于这些抗原，例如通过自然感染或通过用所述特定抗原的有意免疫。

2、增强免疫细胞与潜在靶标之间的相互作用的分子(无论宿主免疫球蛋白的特异性如何)将特别可用于各种疾病的治疗和预防。本文描述了一种用于设计和产生此类分子的策略，所述策略涉及将对宿主产生的免疫球蛋白具有特异性的第一药剂与对细胞或病原体的表面上的抗原具有特异性的第二药剂缀合。通过选择与广泛的宿主免疫球蛋白共享的结构特征(如κ轻链或λ轻链)特异性结合的第一药剂，此类缀合物可以同时与病毒或细胞表面抗原以及广泛的宿主免疫球蛋白中的任一种宿主免疫球蛋白结合，所述免疫球蛋白进而可以与fc受体阳性免疫细胞(如自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞或髓系谱系的其它细胞)结合。以这种方式，这些缀合物可以用于将fc受体阳性免疫细胞募集到靶细胞或病原体，而不依赖于随后将免疫细胞与靶标连接的免疫球蛋白的克隆性或特异性。这些缀合物可以被定制以使免疫细胞靶向任何可想到的抗原，并且可用于增强或引发在对象中的特定细胞或病原体的免疫应答。

3、本公开的一些方面提供了一种缀合物，其包含与免疫球蛋白结合的第一药剂和与细胞或病原体的表面上的靶标结合的第二药剂，其中所述第一药剂和所述第二药剂在化学反应中通过接头共价缀合。

4、在一些实施方式中，所述第一药剂是包含能够与抗原结合的可变区的抗体片段。在一些实施方式中，所述抗体片段包含重链可变区。在一些实施方式中，所述第一药剂是单结构域抗体片段。在一些实施方式中，由所述缀合物募集的免疫球蛋白包含免疫球蛋白κ轻链或免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白κ轻链是人免疫球蛋白κ轻链，并且所述免疫球蛋白λ轻链是人免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方式中，所述第一药剂与所述人免疫球蛋白κ轻链结合。

5、在一些实施方式中，所述第二药剂包括小分子、肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、核苷酸、核酸、寡核苷酸、适体或抗体。在一些实施方式中，所述第二药剂是抗体，所述抗体是单结构域抗体。在一些实施方式中，所述第二药剂在施用于对象时具有治疗效果。

6、在一些实施方式中，所述接头包括可切割接头或不可切割接头。在一些实施方式中，所述接头包括可切割接头。在一些实施方式中，所述可切割接头是肽接头、二硫化物接头或腙接头。

7、在一些实施方式中，所述细胞是被病原体感染的细胞、癌细胞、转化细胞、健康细胞、作为对细胞应激的应答而正在经历或已经经历了表型变化的细胞。在一些实施方式中，所述病原体是病毒、细菌、寄生虫或真菌。

8、在一些实施方式中，所述病原体是选自以下的病毒：流感病毒、冠状病毒、腺病毒、肠病毒、轮状病毒、诺如病毒(norovirus)、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、副粘病毒、弹状病毒、沙粒病毒、黄病毒、披膜病毒、汉坦病毒(hantavirus)、肺炎病毒或埃博拉病毒(ebolavirus)。

9、在一些实施方式中，所述流感病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。在一些实施方式中，所述第二药剂与流感病毒神经氨酸酶或流感病毒血凝素结合。在一些实施方式中，所述第二药剂包括与流感病毒神经氨酸酶结合的小分子。在一些实施方式中，所述第二药剂包括扎那米韦(zanamivir)或其类似物。在一些实施方式中，所述接头是三甘氨酸二苄基环辛炔(dbco)接头。在一些实施方式中，所述第二药剂包括与流感病毒神经氨酸酶结合的抗体或抗体片段。

10、在一些实施方式中，所述冠状病毒是β冠状病毒。在一些实施方式中，所述β冠状病毒是中东呼吸道综合征冠状病毒(mers-cov)、严重急性呼吸系统综合征(sars)相关冠状病毒(sars-cov)-1或sars-cov-2。在一些实施方式中，所述第二药剂与mers-cov刺突蛋白、sars-cov-1刺突蛋白或sars-cov-2刺突蛋白结合。在一些实施方式中，所述第二药剂与mers-cov刺突蛋白受体结合结构域(rbd)、sars-cov-1刺突蛋白rbd或sars-cov-2刺突蛋白rbd结合。

11、在一些实施方式中，所述慢病毒是人免疫缺陷病毒(hiv)。在一些实施方式中，所述第二药剂与hiv包膜糖蛋白gp120结合。

12、在一些实施方式中，所述肺炎病毒是人呼吸道合胞病毒(rsv)。在一些实施方式中，所述第二药剂与rsv融合(f)蛋白结合。

13、在一些实施方式中，所述病原体是选自以下的细菌：巴斯德氏菌(pasteurellaspecies)、葡萄球菌(staphylococcus species)、链球菌(streptococcus species)、芽孢杆菌(bacillus species)、棒杆菌(corynebacterium species)、类白喉菌(diphtheroidsspecies)、李斯特氏菌(listeria species)、丹毒丝菌(erysipelothrix species)、梭菌(clostridium species)、奈瑟氏菌(neisseria species)、布兰汉氏菌(branhamellaspecies)、埃希氏菌(escherichia species)、肠杆菌(enterobacter species)、变形杆菌(proteus species)、假单胞菌(pseudomonas species)、克雷伯氏菌(klebsiellaspecies)、沙门氏菌(salmonella species)、志贺氏菌(shigella species)、沙雷氏菌(serratia species)、不动杆菌(acinetobacter species)、嗜血杆菌(haemophilusspecies)、布鲁氏菌(brucella species)、耶尔森氏菌(yersinia species)、弗朗西丝氏菌(francisella species)、巴氏杆菌(pasteurella species)、霍乱弧菌(vibrio choleraspecies)、黄杆菌(flavobacterium species)、假单胞菌、弯曲杆菌(campylobacterspecies)、拟杆菌(bacteroides species)、梭杆菌(fusobacterium species)、鞘杆菌(calymmatobacterium species)、链杆菌(streptobacillus species)或军团菌(legionella species)。

14、在一些实施方式中，所述病原体是选自以下的寄生虫：疟原虫(plasmodiumspecies)、锥体虫(trypanosoma species)、弓形虫(toxoplasma species)、利什曼原虫(leishmania species)或隐孢子虫(cryptosporidium species)。在一些实施方式中，所述疟原虫是恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、三日疟原虫(plasmodium malariae)、间日疟原虫(plasmodium vivax)、诺氏疟原虫(plasmodium knowlesi)、卵形疟原虫柯氏亚种(plasmodium ovale curtisi)或卵形疟原虫沃氏亚种(plasmodium ovale wallikeri)。在一些实施方式中，所述第二药剂与疟原虫属表面蛋白结合。在一些实施方式中，所述疟原虫属表面蛋白是裂殖子表面蛋白1(msp-1)。在一些实施方式中，所述第二药剂是与msp-1结合的抗体，任选地其中所述抗体是纳米抗体。在一些实施方式中，所述抗体包含表1中所列的抗体中的任一种抗体的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。在一些实施方式中，所述抗体包含与seqid no:6-17中的任一者至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体包含seq id no:6-17中的任一者的氨基酸序列。

15、在一些实施方式中，所述癌细胞是血液癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、脑癌细胞、胃肠癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、前列腺癌细胞、子宫内膜癌细胞、肌肉癌细胞、骨癌细胞、神经内分泌癌细胞、结缔组织癌细胞、头颈癌细胞或皮肤癌细胞。在一些实施方式中，所述第二药剂与肿瘤相关抗原结合。在一些实施方式中，所述肿瘤相关抗原包括mhc i类多肽相关序列a(mica)蛋白、mhc i类多肽相关序列b(micb)蛋白、叶酸受体、纤连蛋白剪接变体、表皮生长因子受体(egfr)、人表皮生长因子受体2(her2)、肝细胞生长因子受体(hgfr)、血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)、c-x-c趋化因子受体4型(cxcr4)、尿激酶纤溶酶原激活剂表面受体(upar)、卵泡刺激素受体(fshr)、上皮细胞粘附分子(epcam)、上皮钙粘蛋白(ecad)、癌胚抗原(cea)或间皮素(msln)。在一些实施方式中，所述第二药剂是与mica结合的抗体，任选地其中所述抗体是纳米抗体。在一些实施方式中，所述抗体包含表2中所列的抗体中的任一种抗体的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。在一些实施方式中，所述抗体包含seq id no:19-27中的任一者的氨基酸序列。

16、在一些实施方式中，所述细胞是癌性骨髓细胞或健康骨髓细胞。在一些实施方式中，所述骨髓相关抗原是分化簇抗原45(cd45)。

17、在一些实施方式中，所述细胞是癌性免疫细胞或健康免疫细胞。在一些实施方式中，所述细胞是癌性t细胞或b细胞、或健康t细胞或b细胞。在一些实施方式中，所述第二药剂与免疫细胞相关抗原结合。在一些实施方式中，所述免疫细胞相关抗原是分化簇抗原4(cd4)、分化簇抗原8(cd8)、t细胞受体(tcr)或b细胞受体(bcr)。

18、在一些实施方式中，所述缀合物在施用于对象时提供治疗效果。在一些实施方式中，所述缀合物在施用于对象时增强表达可结晶片段(fc)受体的一种或多种免疫细胞与所述细胞或病原体之间的缔合。在一些实施方式中，所述缀合物在施用于对象时引起对所述细胞或病原体的杀伤。在一些实施方式中，所述缀合物在施用于对象时引起所述细胞或病原体的失活。在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方式中，所述对象是人。

19、另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含本文所描述的缀合物中的任一种缀合物。在一些实施方式中，此类组合物进一步包含药理学上可接受的赋形剂。

20、另一方面，本公开提供了一种用于增强对象对于细胞或病原体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的本文所描述的任一种缀合物或组合物。在一些实施方式中，所述细胞是被病原体感染的细胞、癌细胞、转化细胞、健康细胞、作为对细胞应激的应答而正在经历或已经经历了表型变化的细胞。在一些实施方式中，所述病原体是病毒、细菌、寄生虫或真菌。在一些实施方式中，所述细胞是所述对象的细胞。

21、在一些实施方式中，所述病原体是选自以下的病毒：流感病毒、冠状病毒、腺病毒、肠病毒、轮状病毒、诺如病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、副粘病毒、弹状病毒、沙粒病毒、黄病毒、披膜病毒、汉坦病毒、肺炎病毒或埃博拉病毒。在一些实施方式中，所述病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。在一些实施方式中，所述病毒是中东呼吸道综合征冠状病毒(mers-cov)、严重急性呼吸系统综合征(sars)相关冠状病毒(sars-cov)-1或sars-cov-2。在一些实施方式中，所述病毒是人免疫缺陷病毒(hiv)。在一些实施方式中，所述病毒是人呼吸道合胞病毒(rsv)。

22、在一些实施方式中，所述病原体是选自以下的细菌：巴斯德氏菌、葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、棒杆菌、类白喉菌、李斯特氏菌、丹毒丝菌、梭菌、奈瑟氏菌、布兰汉氏菌、埃希氏菌、肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、沙雷氏菌、不动杆菌、嗜血杆菌、布鲁氏菌、耶尔森氏菌、弗朗西丝氏菌、巴氏杆菌、霍乱弧菌、黄杆菌、假单胞菌、弯曲杆菌、拟杆菌、梭杆菌、鞘杆菌、链杆菌或军团菌。

23、在一些实施方式中，所述病原体是选自以下的寄生虫：疟原虫、锥体虫、弓形虫、利什曼原虫或隐孢子虫。在一些实施方式中，所述寄生虫是恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、卵形疟原虫柯氏亚种或卵形疟原虫沃氏亚种。

24、在一些实施方式中，所述癌细胞是血液癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、脑癌细胞、胃肠癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、前列腺癌细胞、子宫内膜癌细胞、肌肉癌细胞、骨癌细胞、神经内分泌癌细胞、结缔组织癌细胞、头颈癌细胞或皮肤癌细胞。

25、在一些实施方式中，所述细胞是癌性骨髓细胞或健康骨髓细胞。

26、在一些实施方式中，所述细胞是癌性免疫细胞或健康免疫细胞。在一些实施方式中，所述细胞是癌性t细胞或b细胞、或健康t细胞或b细胞。

27、在一些实施方式中，所述免疫应答包含先天免疫应答。在一些实施方式中，所述缀合物与所述细胞或病原体结合并且与所述对象的免疫球蛋白结合，其中所述免疫球蛋白进一步与所述对象的免疫细胞结合，所述免疫细胞在其表面上表达可结晶片段(fc)受体。在一些实施方式中，所述对象的所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白κ轻链或免疫球蛋白λ轻链。在一些实施方式中，所述对象的所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白κ轻链。在一些实施方式中，所述免疫细胞是巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或肥大细胞。在一些实施方式中，所述施用诱导所述免疫细胞产生一种或多种细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，所述一种或多种细胞因子或趋化因子是促炎细胞因子或趋化因子。在一些实施方式中，所述施用诱导所述免疫细胞对所述细胞或病原体的吞噬作用。在一些实施方式中，所述施用引起对所述细胞或病原体的杀伤。在一些实施方式中，所述施用引起所述细胞或病原体的失活。

28、在一些实施方式中，所述对象是具有病毒感染或有病毒感染的风险的对象。在一些实施方式中，所述对象是患有癌症或有罹患癌症的风险的对象。在一些实施方式中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方式中，所述对象是人。在一些实施方式中，所述对象是人类新生儿、人类婴儿、成年人或老年人。在一些实施方式中，所述对象是伴侣动物、研究动物或驯养动物。

29、在一些实施方式中，所述施用是静脉内的、肌内的、皮内的、皮下的或吸入的。在一些实施方式中，所述施用发生多于一次。在一些实施方式中，所述施用是预防性施用。

30、另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的对象的疾病或降低所述对象患有疾病的风险的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的本文所描述的任一种缀合物或组合物。在一些实施方式中，所述疾病是由病毒、细菌、寄生虫、真菌或癌症引起的疾病。

31、在一些实施方式中，所述病毒是流感病毒、冠状病毒、腺病毒、肠病毒、轮状病毒、诺如病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、副粘病毒、弹状病毒、沙粒病毒、黄病毒、披膜病毒、汉坦病毒、肺炎病毒或埃博拉病毒。在一些实施方式中，所述病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒。在一些实施方式中，所述病毒是中东呼吸道综合征冠状病毒(mers-cov)、严重急性呼吸系统综合征(sars)相关冠状病毒(sars-cov)-1或sars-cov-2。在一些实施方式中，所述病毒是人免疫缺陷病毒(hiv)。在一些实施方式中，所述病毒是人呼吸道合胞病毒(rsv)。

32、在一些实施方式中，所述细菌是巴斯德氏菌、葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、棒杆菌、类白喉菌、李斯特氏菌、丹毒丝菌、梭菌、奈瑟氏菌、布兰汉氏菌、埃希氏菌、肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、沙雷氏菌、不动杆菌、嗜血杆菌、布鲁氏菌、耶尔森氏菌、弗朗西丝氏菌、巴氏杆菌、霍乱弧菌、黄杆菌、假单胞菌、弯曲杆菌、拟杆菌、梭杆菌、鞘杆菌、链杆菌或军团菌。

33、在一些实施方式中，所述寄生虫是疟原虫、锥体虫、弓形虫、利什曼原虫或隐孢子虫。在一些实施方式中，所述寄生虫是恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、卵形疟原虫柯氏亚种或卵形疟原虫沃氏亚种。

34、在一些实施方式中，所述癌症是血液癌、肺癌、乳腺癌、脑癌、胃肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肌肉癌、骨癌、神经内分泌癌、结缔组织癌、头颈癌或皮肤癌。在一些实施方式中，所述癌症是转移性癌症。

35、在一些实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一些实施方式中，所述对象是人。在一些实施方式中，所述对象是人类新生儿、人类婴儿、成年人或老年人。在一些实施方式中，所述对象是伴侣动物、研究动物或驯养动物。

36、在一些实施方式中，所述施用是静脉内的、肌内的、皮内的、皮下的或吸入的。在一些实施方式中，所述施用发生多于一次。在一些实施方式中，所述施用是预防性施用。

37、本公开的其它方面提供了包含表1中所列的抗体中的任一种抗体的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的抗体。在一些实施方式中，所述抗体包含与seq id no:6-17中的任一者至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体包含seq id no:6-17中的任一者的氨基酸序列。

38、本公开的其它方面提供了包含表2中所列的抗体中的任一种抗体的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的抗体。在一些实施方式中，所述抗体包含与seq id no:19-27中的任一者至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体包含seq id no:19-27中的任一者的氨基酸序列。

39、以上技术实现要素：旨在以非限制性的方式说明本文所公开的技术的一些实施方式、优点、特征和用途。本文所公开的技术的其它实施方式、优点、特征和用途通过具体实施方式、附图、实施例和权利要求书将变得显而易见。