一种基于尾鳍成纤维细胞培养的鲫鱼染色体核型分析方法与流程

本发明涉及染色体核型分析，具体涉及一种基于尾鳍成纤维细胞培养的鲫鱼染色体核型分析方法。

背景技术：

1、鲫鱼隶属于鲤形目、鲤科、鲫属，因其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富，即可食用又可药用，深受大众推崇，具有较高的经济价值。鲫鱼适应性非常强，易饲养，除高原以外，几乎遍布于江河湖泊、池塘水库和沼泽河沟等大小水体中。鲫鱼是产量稳步持续增长的淡水养殖鱼类之一，在淡水养殖中占据十分重要的地位。长期以来，野生鲫鱼一直被认为是二倍体群体，但自二十世纪80年代以来，在野生鲫鱼中陆续开始报道有三倍体的存在，如高背鲫、缩骨鲫、普安鲫、彭泽鲫。因此，对土著鲫鱼开展染色体核型分析，不仅有助于了解生物的遗传组成、遗传变异规律和发育机制，而且对预测鉴定种间杂交和多倍体育种的结果、了解性别遗传机理以及基因组数、物种起源、进化关系都具有重要的参考价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于尾鳍成纤维细胞培养的鲫鱼染色体核型分析方法，能够获得生长状况良好的成纤维细胞，有助于增加处于分裂相的细胞个数，提高处于中期分裂相的细胞比率，获得更多处于大量分布均匀、形态良好的中期染色体。

2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

3、一种基于尾鳍成纤维细胞培养的鲫鱼染色体核型分析方法，包括：

4、使用细胞培养基进行尾鳍成纤维细胞的培养，对培养后的尾鳍成纤维细胞进行染色体核型分析；细胞培养基包括原代培养基和/或传代培养基，细胞培养基包括dmem培养基，以及细胞营养剂和细胞培养添加剂至少1种；细胞培养添加剂至少包括阿魏酸姜黄素酯衍生物和黄原胶琥珀酸酯衍生物，阿魏酸姜黄素酯衍生物具有苯酚基团和酯基，黄原胶琥珀酸酯衍生物具有丙酮酸基团和酯基。阿魏酸姜黄素酯衍生物和黄原胶琥珀酸酯衍生物均具有良好的体外抗氧化活性，可有效清除外界环境和细胞代谢过程中产生的大量活性氧，保护细胞免受氧化应激损伤，获得生长状况良好的成纤维细胞。黄原胶琥珀酸酯衍生物具有丙酮酸基团，对成纤维细胞的生长和增殖具有良好的促进作用，有助于增加处于分裂相的细胞个数，提高处于中期分裂相的细胞比率。

5、优选地，dmem培养基和细胞营养剂的体积比为1：0.1-1.0。

6、优选地，dmem培养基和细胞培养添加剂的液固比为1ml：0.01-0.10g。

7、优选地，细胞营养剂包括胎牛血清，碱性成纤维细胞生长因子和青霉素-链霉素双抗。

8、更优选地，胎牛血清和碱性成纤维细胞生长因子的体积比为1：0.02-1.00。

9、更优选地，胎牛血清和青霉素-链霉素双抗的体积比为1：0.02-1.00。

10、优选地，阿魏酸姜黄素酯衍生物由阿魏酸和姜黄素在二环已基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶反应体系下进行酯化反应得到。

11、更优选地，阿魏酸姜黄素酯衍生物的制备方法，具体为，

12、将姜黄素加入n,n-二甲基甲酰胺并搅拌至溶清，加入二环已基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，冰浴降温至2-10℃时加入阿魏酸继续进行反应，期间控制体系内温度为2-10℃，反应完全后抽滤除去n,n-二环己基脲，将得到的滤液用冰水淋洗抽滤，待得到的粗产物用洗脱剂洗脱，通过柱层析法分离纯化得到阿魏酸姜黄素酯衍生物。

13、更进一步优选地，姜黄素和n,n-二甲基甲酰胺的固液比为1g：10-20ml。

14、更进一步优选地，姜黄素和二环已基碳二亚胺的质量比为1：1-2。

15、更进一步优选地，姜黄素和4-二甲氨基吡啶的质量比为1：0.02-0.10。

16、更进一步优选地，姜黄素和阿魏酸的质量比为1：1-2。

17、更进一步优选地，洗脱剂包括乙酸乙酯和石油醚，乙酸乙酯和石油醚的体积比为1：0.1-1.0。

18、优选地，黄原胶琥珀酸酯衍生物先由双氧水在碱性条件下降解黄原胶，获得水溶性黄原胶寡糖，再与琥珀酸酐发生酯化反应得到。

19、更优选地，黄原胶琥珀酸酯衍生物的制备方法，具体为，

20、将黄原胶溶于氢氧化钠溶液中，加入过氧化氢溶液，在60-100℃下降解2-10d，冷却后用氢氧化钠溶液调节ph至中性，分别使用微孔过滤器和透析袋过滤，将反应液在去离子水中透析，加入琥珀酸酐和丙酮，加热至20-60℃搅拌2-6h，获得沉淀并使用丙酮洗涤2-5遍，真空干燥12-48h，获得黄原胶琥珀酸酯衍生物。

21、更进一步优选地，黄原胶和氢氧化钠溶液的固液比为1g：20-100ml。

22、更进一步优选地，氢氧化钠溶液的浓度为0.01-1.00mol/l。

23、更进一步优选地，黄原胶和过氧化氢溶液的固液比为1g：1-2ml。

24、更进一步优选地，过氧化氢溶液的质量分数为10-50%。

25、更进一步优选地，黄原胶和琥珀酸酐的质量比为1：0.01-0.10。

26、更进一步优选地，黄原胶和丙酮溶液的固液比为1g：1-2ml。

27、优选地，细胞培养添加剂包括阿魏酸姜黄素酯衍生物和黄原胶琥珀酸酯衍生物。

28、优选地，细胞培养添加剂包括阿魏酸姜黄素酯衍生物、黄原胶琥珀酸酯衍生物和乙酰丙酸乙酯。该细胞培养添加剂中加入乙酰丙酸乙酯能够获得更多生长状况良好的成纤维细胞，进一步增加处于分裂相的细胞个数，提高处于中期分裂相的细胞比率，获得更多处于大量分布均匀、形态良好的中期染色体。

29、更优选地，阿魏酸姜黄素酯衍生物和黄原胶琥珀酸酯衍生物的质量比为1：1-2。

30、更优选地，阿魏酸姜黄素酯衍生物和乙酰丙酸乙酯的质量比为1：1-2。

31、优选地，鲫鱼尾鳍成纤维细胞的原代培养，具体为，

32、将鲫鱼置于高锰酸钾溶液中消毒20-40min，剪取0.2-1.0cm3尾鳍并使用质量分数为75%的乙醇消毒10-30s，使用缓冲液漂洗3-7次，将尾鳍划分成0.2-1.0mm3的组织块，再使用缓冲液漂洗3-7次，将尾鳍接种于6孔板，尽量吸取水分，置于二氧化碳培养箱倒置培养10-60min，加入体积分数为0.25%的胰蛋白酶溶液消化5-30min，使用原代培养基终止消化，去除原代培养基和胰蛋白酶溶液，加入原代培养基，置于二氧化碳培养箱中培养，每2天更换一半原代培养基。

33、更优选地，高锰酸钾溶液的质量分数为0.01-1.00%。

34、更优选的，缓冲液由青霉素-链霉素双抗和d-hanks缓冲液混合配制，青霉素-链霉素双抗和d-hanks缓冲液的体积比为1：20-100。

35、更优选地，二氧化碳培养箱的温度为25-28℃，二氧化碳的质量分数为4-6%。

36、更优选地，尾鳍组织块和胰蛋白酶溶液的用量比为1mm3：0.5-2.0ml。

37、更优选地，尾鳍组织块和原代培养基的用量比为1mm3：1-2ml。

38、优选地，鲫鱼尾鳍成纤维细胞的传代培养，具体为，

39、待原代尾鳍成纤维细胞长至80-90%汇合度，去除原代培养基，加入缓冲液润洗1-3次，去除缓冲液，加入体积分数为0.25%的胰蛋白酶溶液消化5min，加入传代培养基终止消化，以100-1000g离心2-4min，去除上清液，使用传代培养基重悬细胞，按1：3的比例接种至新的6孔板，置于二氧化碳培养箱中培养，每2天更换一半培养基。

40、更优选地，胰蛋白酶溶液和传代培养基的体积比为1：0.2-1.0。

41、优选地，鲫鱼尾鳍细胞核型分析，包括，

42、以2×106每孔细胞量将鲫鱼尾鳍成纤维细胞接种至t25细胞培养皿，待细胞长至50-60%汇合度，更换新的传代培养基，待细胞长至70-80%汇合度，加入秋水仙素处理3-6h，去除传代培养基后加入缓冲液润洗1-3次，去除缓冲液，加入体积分数为25%的胰蛋白酶溶液消化2-10min，加入传代培养基终止消化，以100-1000g离心2-5min，去除上清液，加入氯化钾溶液重悬，在27℃下低渗10-60min，加入卡诺固定液预固定2-10min，以100-2000g离心2-10min，去除上清液，加入预冷的卡诺固定液，卡诺固定液的预冷温度为-20℃，轻轻重悬细胞，在-20℃下固定10-60min，再以100-2000g离心2-10min，去除上清液，加入预冷的卡诺固定液，卡诺固定液的预冷温度为-20℃，轻轻重悬细胞，在-20℃下固定10-60min，再以100-2000g离心2-10min，吸去上清液，使用胶头滴管轻轻重悬细胞，在0.5-1.5m高处将细胞悬液滴至-20℃遇冷的黏附载玻片上，迅速吹散，在37℃干片10-60min，使用吉姆萨染色液染色2-10min，轻轻洗去染液，观察后使用中性树脂和盖玻片封片，于100倍油镜拍摄核型。

43、更优选地，传代培养基和秋水仙素的液固比为1ml：0.5-5.0μg。

44、更优选地，传代培养基和胰蛋白酶溶液的体积比为1：0.2-2.0。

45、更优选地，氯化钾溶液的浓度为0.01-0.10mol/l。

46、更优选地，传代培养基和氯化钾溶液的体积比为1：1-2。

47、更优选地，卡诺固定液包括甲醇和乙酸，甲醇和乙酸的体积比为1：0.2-1.0。

48、更优选地，传代培养基和卡诺固定液的体积比为1：0.01-5.00。

49、更优选地，传代培养基和吉姆萨染色液的体积比为1：0.2-2.0。

50、本发明还公开了一种细胞培养添加剂，包括阿魏酸姜黄素酯衍生物和黄原胶琥珀酸酯衍生物。

51、本发明还公开了细胞培养添加剂在染色体核型分析的用途。

52、本发明由于使用了含有细胞培养添加剂的传代培养基进行鲫鱼尾鳍成纤维细胞的传代培养，细胞培养添加剂包括阿魏酸姜黄素酯衍生物，黄原胶琥珀酸酯衍生物和乙酰丙酸乙酯，因而具有如下有益效果：阿魏酸姜黄素酯衍生物和黄原胶琥珀酸酯衍生物均具有良好的体外抗氧化活性，能够捕获、中和和清除自由基，有效减少外界环境和细胞代谢过程中活性氧的含量，保护细胞免受氧化应激损伤，获得生长状况良好的成纤维细胞。黄原胶琥珀酸酯衍生物具有丙酮酸基团，对成纤维细胞的生长和增殖具有良好的促进作用，有助于增加处于分裂相的细胞个数，提高处于中期分裂相的细胞比率。乙酰丙酸乙酯能进一步促进细胞的生长和增殖，有助于获得更多处于中期分裂相的细胞，从而获得大量分布均匀、形态良好的中期染色体。