一种乳清酸高产菌株的构建方法

本发明涉及生物工程技术、基因工程、分子生物学、代谢工程等领域，具体涉及到乳清酸高产大肠杆菌的构建及其方法与应用。

背景技术：

1、乳清酸(orotic acid，oa)，也被称为vb13，是嘧啶核苷酸生物合成的中间体。因此，它是通常用作核苷酸的前体物质，如胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶；它被广泛用作镁、锌、锂离子的载体治疗矿物质缺乏的药物制剂，另外乳清酸与嘌呤并用可以有效的促进儿童发育；乳清酸的一些衍生物对心脏类疾病有着良好治疗效果。乳清酸类药物以其疗效好、副作用小、对肾脏无刺激，体内残留和积累量低等特点备受青睐与关注。近年来开发研究出乳清酸用于核酸的合成，核酸是生命的主要物质，对于研究蛋白质的生物合成以及人类遗传学都具有非常重要的意义，目前已经开发出以其为原料生产的核酸类保健食品与药物，能影响和控制许多生命代谢活动，对延缓人体衰老具有明显效果。随着对oa研究的逐步深入，市场对oa的需求也在不断扩大功能。

2、现阶段乳清酸的合成主流方法是化学合成法，但是乳清酸化学合成存在种种问题，比如：成本高、效率低、严重污染环境等。生物合成法作为一种绿色经济环保安全的合成方法，它将是一种很有前途的替代方法。

3、本发明通过改造大肠杆菌乳清酸合成途径，增强氨甲酰磷酸前体供应量，敲除相关抑制蛋白基因，构建无质粒菌株，提高工程菌株生产稳定性，节约生产成本，生产乳清酸的产量7.8g/l。

技术实现思路

1、本发明提供了一种乳清酸高产菌株的构建方法。

2、本发明提供一种利用葡萄糖、甘油等简单碳源来合成乳清酸的工程菌。

3、本发明构建的基因工程菌，通过加强氨甲酰磷酸盐的供应量，增强氰酸盐的外排，敲除限速步骤的抑制蛋白基因，构建了稳定遗传的基因工程菌株。实验结果表明，该工程菌株利用葡萄糖为简单碳源来生产乳清酸能达到7.8g/l的最终产量。

4、本发明提供了一种上述高产乳清酸工程菌的构建方法，利用crispr基因编辑技术在大肠杆菌整合了基因cynt(碳酸酐酶)，加强细胞对二氧化碳的吸收并且提高碳酸氢盐的供应量。由于氰酸盐可以特异性抑制氨甲酰磷酸合成酶的活性,所以整合了基因cynx(氰酸盐转运体)，增强了氰酸盐的外排减轻了对氨甲酰磷酸的抑制作用。敲除了purr、pepa和argr三种转录抑制蛋白，增强基因cara/carb的表达。上述基因的整合位点，由lpp启动子表达的基因cynt基因组上的假意义基因gapc，基因cynx替换基因组上的假意义基因yciq。

5、本发明还提供一种乳清酸高产整合菌的应用，其中，将上述工程菌划线于无抗生素的平板上，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆转化子，得到乳清酸的基因工程菌株，将其接种到发酵培养基中，在37℃进行发酵从头合成生产乳清酸。发酵培养基为m10培养基，主要成分包含：25g/l葡萄糖、16g/l硫酸铵、2g/l酵母粉、1g/l kh2po4、1g/l mgso4、10g/lcaco3，溶剂为水。

6、本发明提供的基因工程菌是通过削弱氰酸盐对氨甲酰磷酸的特异性抑制作用，并且敲除了对氨甲酰磷酸合成酶的三种抑制蛋白，从头合成乳清酸，最终乳清酸的产量能达到7.8g/l。本发明提供的上述基因工程菌与传统质粒表达菌株相比，优势在于(1)该基因工程菌在生产发酵过程中稳定性要明显高于质粒重组菌株，且产量明显高于质粒重组菌株(2)该基因工程菌的生产更节约成本，再进行发酵生产过程中无需添加抗生素和诱导剂，只要有充足的碳源就可以在确保该菌株稳定遗传的同时实现乳清酸高效生物合成。利用本发明提供的合成乳清酸的工程菌生产乳清酸具有方法简单、成本低廉等优点，有利于工业化放大生产，降低生产成本，为乳清酸工业化生产提供了重要的依据。

技术特征：

1.一种乳清酸高产菌株的构建方法，其特征在于：在温度为37℃，转速为220rpm条件下，在敲除相关基因乳清酸磷酸核糖转移酶(pyre)，可以将葡萄糖等简单碳源催化生成乳清酸。

2.根据权利要求1所述的一种乳清酸高产菌株的构建方法，其特征在于：生物合成乳清酸途径的宿主细胞包括细菌、真菌等，也包括改造过的细菌、真菌等。

3.一种乳清酸高产菌株的构建方法策略，其特征在于：

4.一种乳清酸高产菌株的构建方法，其特征在于：同时实施权利要求1、2、3，并将乳清酸合成的相关基因整合进宿主细胞。

技术总结本发明提供了一种构建生物合成乳清酸的工程菌的方法，利用CRISPR基因编辑技术在大肠杆菌基因组整合基因cynT(碳酸酐酶)，加强细胞对二氧化碳的吸收并且提高碳酸氢盐的供应量，由于氰酸盐可以特异性抑制氨甲酰磷酸合成酶的活性，所以整合了基因cynX(氰酸盐转运体)，增强了氰酸盐的外排减轻了对氨甲酰磷酸的抑制作用。敲除了purR、pepA和argR三种转录抑制蛋白，增强基因carA/carB的表达，提高氨甲酰磷酸的供应量。上述基因工程菌与原始的需要导入质粒生产乳清酸重组工程菌相比，利用此工程菌生产乳清酸具有稳定性强、转换率高和产量高等优点。技术研发人员：孙新晓,袁其朋,陈阳,申晓林,王佳受保护的技术使用者：北京化工大学技术研发日：技术公布日：2024/11/18