用于使细胞外基质脱细胞的新方法与流程

本公开内容描述了一种用于使细胞外基质脱细胞的新方法以及包含所述脱细胞的细胞外基质的用于各种用途的组合物。

背景技术：

1、皮肤是哺乳动物身体最大的器官，是身体的外覆盖层，其具有三大功能：微生物防护和过度水分流失、调节体温以及感知触觉、热和冷。哺乳动物皮肤有两个主要层，表皮和真皮。表皮是皮肤的最外层，其防止微生物进入并保持我们体内的水分，它是由角质形成细胞构成的复层鳞状上皮。真皮是表皮下面的皮肤层，其是皮肤附属物所在的位置，并通过由胶原纤维、弹性纤维、透明质酸和蛋白聚糖构成的细胞外基质为皮肤提供弹性。真皮和表皮由被称为基底膜的薄纤维层隔开，基底膜在重塑、修复和再生过程中调节真皮和表皮之间细胞和分子(例如细胞因子和生长因子)的流动。真皮下面是皮下组织，其由疏松结缔组织(例如脂肪)和弹性蛋白构成。皮下组织的主要细胞包括成纤维细胞、巨噬细胞和脂肪细胞。

2、损伤或疾病会造成器官或组织(例如皮肤)形态和功能的中断。损伤后器官或组织的重塑和修复是一个复杂的伤口愈合过程，涉及细胞、生长因子和细胞外基质(ecm)之间的相互作用。成年哺乳动物中的这个过程涉及众所周知的阶段：体内平衡、炎症、增殖、成熟和重塑。在体内平衡期间，会发生凝血以止血。炎症涉及将白细胞、抗体、营养物质和酶募集到受影响区域以加速伤口愈合。在增生过程中，新的健康肉芽组织(例如新的结缔组织和血管)会取代伤口。成熟和重塑在伤口闭合后发生，并涉及修复真皮组织以提高其抗拉强度。

3、与修复过程(其中目标是重新建立功能而不考虑受伤组织的确切位置)相反，再生是用精确的复制品替换受伤组织，使得形态和功能完全恢复。例如，未受伤的皮肤会随着新细胞的替换而不断发生完全再生。然而，受伤的成年哺乳动物皮肤不会完全再生，而是会留下疤痕。

4、与哺乳动物不同，有尾目动物(urodele)在深层皮肤损伤后会再生其皮肤结构，包括真皮和分泌腺，而不会形成疤痕。据报道，有尾目动物的细胞外基质(ecm)可能具有对伤口愈合很重要的理想特性，使其成为用于伤口愈合、异种移植和其他皮肤病症的生物材料的理想来源。因此，有尾目动物的ecm可以提供用于哺乳动物的组织修复和再生的模型以及用于治疗包括皮肤在内的哺乳动物组织的组合物的起始材料。

5、有尾目动物的ecm包含用于维持结构和生化功能和特性的天然细胞和遗传物质。然而，有尾目动物ecm的天然细胞和遗传物质会在受试者中诱发不希望的效果和免疫反应。脱细胞是一种从组织中去除天然细胞和遗传物质而不影响组织的结构和功能完整性的过程。然后可以将脱细胞的组织用于受试者。然而，需要开发一种改进的方法来获得可以有效地用于受试者、尤其是哺乳动物受试者的脱细胞的有尾目动物ecm。

技术实现思路

1、本技术实现要素：并非旨在识别所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也并非旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

2、本公开内容提供了使两栖动物的生物样品脱细胞的新的和改进的方法。在实施方案中，生物样品包含ecm并且是从幼态持续(neotenic)的有尾目动物(例如，钝口螈(ambystoma)杂交种)或幼体阶段的幼年无足目动物(apoda)(蛙/蝌蚪)物种中收获的。

3、该方法包括用一种或多种表面活性剂洗涤样品，以及将样品与一种或多种蛋白酶和一种或多种核酸酶一起孵育。在实施方案中，该方法包括用一种或多种洗涤剂溶液洗涤样品、用一种或多种蛋白酶处理样品以及用一种或多种核酸酶处理蛋白酶处理的样品以获得可在体外和/或体内使用的分离的ecm。一种或多种洗涤剂溶液包含一种或多种非离子表面活性剂，例如tritontmx-100reduced，和/或阴离子洗涤剂，例如n-十二烷基肌氨酸(nls)。一种或多种蛋白酶包含氨基内切肽酶，例如分散酶ii。一种或多种核酸酶包含dna/rna内切核酸酶，例如核酸酶。脱细胞后，分离的ecm样品可以微粉化并脱水储存。

4、本公开内容还描述了分离的ecm和包含分离的ecm的组合物。分离的ecm中去除了超过70％的其细胞，但ecm的结构和/或功能架构保持完整。分离的ecm包含少于20ng/mg的干ecm(或少于10ng/μl的dna提取物)。分离的ecm中的残留dna片段的长度小于300个碱基对(bp)。

5、分离的ecm和组合物可用于器官和组织再生、作为植入物以及用于治疗皮肤病症。

技术特征：

1.一种分离的两栖动物ecm，其中，所述ecm是脱细胞的，并且所述ecm包含：

2.根据权利要求1所述的ecm，其中，所述ecm包含所述相应天然ecm样品中存在的dna总量的2％至10％。

3.根据权利要求1所述的ecm，其中，所述ecm包含长度为50bp至300bp的残留dna片段。

4.根据权利要求3所述的ecm，其中，所述ecm包含长度小于250bp的残留dna片段。

5.根据权利要求1所述的ecm，其中，所述ecm已去除了80％至90％的其细胞。

6.根据权利要求1所述的ecm，其中，所述ecm为干粉、糊剂、溶液、提取物、乳膏、洗剂、分散体或乳剂的形式。

7.根据权利要求1所述的ecm，其中，所述ecm获自幼年两栖动物，任选地，所述幼年两栖动物包括幼蛙、蝌蚪、有尾目动物或幼体阶段幼年无足目动物。

8.根据权利要求1所述的ecm，其中，所述ecm获自幼态持续的有尾目动物。

9.一种组合物，其中，所述组合物包含载体和根据权利要求1至8中任一项所述的ecm。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物是药物组合物或美容组合物，并且任选地，其中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，并且其中所述美容组合物包含美容上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物还包含一种或多种药剂，并且任选地，其中，所述一种或多种药剂对于分离的ecm是异种的。

12.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物还包含一种或多种药剂，所述一种或多种药剂包含肽、蛋白质、药物、营养素、类视黄醇、润肤剂、类固醇、碳水化合物、糖蛋白、聚合物或其组合。

13.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物还包含一种或多种生长因子、细胞因子、趋化因子或其组合。

14.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物还包含一种或多种聚合物，并且任选地，其中，所述一种或多种聚合物是合成的或天然的聚合物或共聚物。

15.一种使两栖动物ecm脱细胞的方法，其中，所述方法包括：从两栖动物收获生物样品，用洗涤剂溶液洗涤所述样品，以及用一种或多种蛋白酶和一种或多种核酸酶处理所述样品以获得分离的ecm。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述方法包括：从两栖动物收获生物样品，用溶液冲洗所述样品，用洗涤剂溶液洗涤所述样品，用蛋白酶处理所述样品，在蛋白酶处理后冲洗所述样品，以及用核酸酶处理冲洗过的蛋白酶处理的所述样品，以获得分离的ecm，并且任选地，进一步洗涤所述分离的ecm。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述方法包括：用水或缓冲溶液、任选地用磷酸盐缓冲盐水(pbs)或杜氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)冲洗所述样品。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，用包含一种或多种表面活性剂的洗涤剂溶液洗涤所述样品，并且任选地，其中，所述一种或多种表面活性剂包含一种或多种非离子表面活性剂或阴离子表面活性剂。

19.根据权利要求16所述的方法，其中，用包含2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇、聚氧乙烯(10)异辛基环己基醚、聚乙二醇醚或三甲基壬基聚乙二醇的洗涤剂溶液洗涤所述样品。

20.根据权利要求16所述的方法，其中，用包含n-十二烷基肌氨酸(nls)、十二烷基肌氨酸钾、胆酸盐、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸钠(sds)或聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、任选地吐温20、吐温40、吐温60或吐温80的洗涤剂溶液洗涤所述样品。

21.根据权利要求16所述的方法，其中，将所述样品与一种或多种蛋白酶一起孵育，所述一种或多种蛋白酶包含一种或多种氨基内肽酶，并且任选地，其中，所述一种或多种蛋白酶包含分散酶i、分散酶ii、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胶原酶中的一种或多种蛋白酶。

22.根据权利要求16所述的方法，其中，将所述样品与一种或多种核酸酶一起孵育，所述一种或多种核酸酶包含非特异性dna/rna内切酶，并且任选地，其中，所述一种或多种核酸酶包含全能核酸酶、涡轮核酸酶、阿法链道酶、以及dnase和rnase的组合，任选地包含重组dnase和rnase。

23.根据权利要求16所述的方法，其中，所述方法包括按下列顺序的以下步骤：

24.根据权利要求23所述的方法，其中，伴随振动用洗涤剂溶液洗涤所述样品6小时。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，在用洗涤剂溶液进行洗涤和用蛋白酶进行处理之间以及在用蛋白酶进行处理和用核酸酶进行处理之间，用dpbs冲洗所述样品5分钟。

26.根据权利要求16所述的方法，其中，所述两栖动物包括幼蛙、蝌蚪、有尾目动物或幼体阶段的幼年无足目动物。

27.根据权利要求16所述的方法，其中，所述生物样品包含来自幼态持续的有尾目动物的ecm组织。

28.根据权利要求16所述的方法，其中，所述生物样品包括结缔组织、脂肪组织、骨、血浆、皮肤、软骨、肌腱、硬脑膜或筋膜的ecm。

29.根据权利要求16所述的方法，其中，所述分离的ecm被进一步微粉化。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述分离的ecm可以被微粉化至约1至1000微米、1至900微米、1至800微米、1至700微米、1至600微米、1至500微米、1至400微米、1至300微米、1至200微米、100至300微米、100至250微米、100至200微米、100至150微米或100至125微米的粒度。

31.一种分离的ecm，其通过根据权利要求15至30中任一项所述的方法获得。

32.根据权利要求31所述的组合物，其中，所述组合物是药物组合物或美容组合物，并且任选地，其中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，并且其中，所述美容组合物包含美容上可接受的载体。

33.一种治疗和/或预防皮肤病症的方法，其中，所述方法包括：向有需要的受试者施用根据权利要求1至8或31中任一项的分离的ecm或根据权利要求10至14或32中任一项所述的组合物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述皮肤病症包括细纹和/或皱纹、老化、发红、擦伤、烧伤、割伤、感染、剃须疹、疤痕、肤色不均、疼痛、妊娠纹、增加皮肤弹性和/或紧致度、改善皮肤水合作用、炎症和色素沉着过度。

35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述预防皮肤病症包括保护皮肤免受包括紫外线和/或环境污染的损害。

技术总结本公开内容描述了一种使两栖动物细胞外基质脱细胞以获得基本上不含细胞碎片和核碎片的分离的ECM的新方法。该方法包括在包含一种或多种表面活性剂的溶液中洗涤两栖动物ECM、将ECM与一种或多种蛋白酶一起孵育以及将ECM与一种或多种核酸酶一起孵育。本公开内容还描述了使用分离的ECM的各种方法。技术研发人员：雷蒙·蒙特罗,J-H·曹,伊丽莎白·科森受保护的技术使用者：瑞根克斯科学股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18