一种无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌及其构建方法与流程

本发明涉及一种无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌及其构建方法，属于微生物。

背景技术：

1、高尿酸血症(hyperuricemia，hua)是指机体嘌呤代谢紊乱，尿酸分泌过多或肾脏排泄功能障碍，使尿酸在血液中积聚的状态。血清尿酸超过其在血液或组织液中的饱和度可在关节局部形成单钠尿酸盐(msu)结晶并沉积，诱发局部炎性反应和组织破坏，即痛风。近年来，我国人民生活水平不断得到提高，研究发现hua患病率呈现增高的趋势，目前用于抗高尿酸血症的药物主要有三大类：黄嘌呤氧化酶抑制剂、尿酸盐阴离子转运蛋白1(urat1)抑制剂和尿酸氧化酶。痛风的生化标志是高尿酸血症，指细胞外液的尿酸盐呈超饱和状态，一般认为血清尿酸大于417μmol/l时为高尿酸血症，约5％-12％高尿酸血症患者会发展成为痛风。高尿酸血症及原发性痛风与肥胖症、高脂血症、高血压病、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病呈显著正相关。因此，痛风是危害人类健康的一种严重的代谢性疾病。

2、尿酸氧化酶(urateoxidase，ec1.7.3.3)，又称尿酸酶(uricase)，是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，大部分生物在嘌呤的代谢过程中产生尿酸，而尿酸酶能催化尿酸氧化为尿囊素。许多物种中均发现有尿酸酶存在，在自然演化进程中人类因丢失了尿酸酶基因从而导致不能合成尿酸酶，尿酸酶基因发生突变，使体内的嘌呤不能被氧化为尿囊素，而是以尿酸为终产物。构建含有尿酸氧化酶的工程菌可以用于预防和治疗高尿酸血症。

3、大肠埃希菌nissle1917，简称ecn，是唯一一种不致病的大肠杆菌，是一种益生菌，可以用于构建含有尿酸氧化酶的工程菌。通常ecn在应用时需使用工程化的质粒载体，这种质粒载体工程简单，但通常需要抗生素来维持。在肠道的活体治疗使用中，抗生素的使用通常与治疗不相容，并且严重限制了其实验。在没有抗生素选择的情况下，该质粒则极容易发生丢失。因此，这种大肠杆菌用于构建工程菌时需要抗性标记。然而，构建工程菌时增加抗性标记会增加工程菌的构建复杂度和成本。

技术实现思路

1、本发明提供了一种无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌及其构建方法，可以有效解决上述问题。

2、本发明是这样实现的：

3、一种尿酸氧化酶基因片段，所述尿酸氧化酶基因片段包括信号肽pelb及尿酸氧化酶编码基因uox，所述信号肽pelb的序列如seq id no:3所示，所述尿酸氧化酶编码基因uox的序列如seq id no:4所示。

4、在一些实施例中，所述尿酸氧化酶基因片段还包括启动子p32和终止子t1。

5、在一些实施例中，所述启动子的序列如seq id no:2所示；所述终止子的序列如seq id no:5所示。

6、一种无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌，所述尿酸氧化酶工程菌为在基因组中整合了上述的尿酸氧化酶基因片段的重组菌。

7、在一些实施例中，所述尿酸氧化酶工程菌为在ecn菌或ecn-δlpp菌的基因组中的uspg和rnk之间的非编码区域(689269-689288)、pnta和ydgh之间的非编码区域(1766918-1766937)分别整合了上述的尿酸氧化酶基因片段的重组菌。

8、一种上述的无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌在制备降低尿酸的药物中的应用。

9、一种无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌的构建方法，包括以下步骤：

10、s1，将尿酸氧化酶编码基因uox的序列进行密码子优化，优化后的序列如seq idno:4所示；将信号肽pelb的序列优化，优化后的如seq id no:3所示；

11、s2，采用重叠pcr技术构建尿酸氧化酶表达框；

12、s3，采用crispr/cas9系统将尿酸氧化酶表达框整合进底盘菌株的基因组中，构建成所述无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌。

13、在一些实施例中，所述底盘菌株为ecn菌或ecn-δlpp菌。

14、在一些实施例中，所述尿酸氧化酶表达框整合进底盘菌株ecn菌或ecn-δlpp菌的基因组中的位点为uspg和rnk之间的非编码区域(689269-689288)、pnta和ydgh之间的非编码区域(1766918-1766937)。

15、在一些实施例中，步骤s2中，构建尿酸氧化酶表达框的启动子为p32，其序列如seqid no:2所示，终止子为t1，其序列如seq id no:5所示。

16、本发明的有益效果是：

17、本发明通过crispr/cas9系统将尿酸氧化酶表达框基因敲入ecn基因组的位点，特别是针对尿酸氧化酶uox基因序列根据密码子偏好性和gc含量进行了密码子优化，提高了基因表达水平，构建了无需抗性标记即可稳定表达的尿酸氧化酶的工程菌，并能有效降解尿酸。

18、本发明尿酸氧化酶表达框基因整合进ecn基因组，不需整合质粒，避免整合质粒对细菌生长活性产生不利影响。本发明在尿酸氧化酶表达框中插入一个氨基酸序列优化的pelb信号肽作为蛋白分泌系统，使重组尿酸氧化酶分泌至胞外，减少了包涵体生成，获得更多有活性的重组蛋白并达到更好的分泌效果。

技术特征：

1.一种尿酸氧化酶基因片段，其特征在于，所述尿酸氧化酶基因片段包括信号肽pelb及尿酸氧化酶编码基因uox，所述信号肽pelb的序列如seq id no:3所示，所述尿酸氧化酶编码基因uox的序列如seq id no:4所示。

2.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶基因片段，其特征在于，所述尿酸氧化酶基因片段还包括启动子p32和终止子t1。

3.根据权利要求2所述的尿酸氧化酶基因片段，其特征在于，所述启动子p32的序列如seq id no:2所示；所述终止子t1的序列如seq id no:5所示。

4.一种无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌，其特征在于，所述尿酸氧化酶工程菌为在基因组中整合了权利要求1至3任一项所述的尿酸氧化酶基因片段的重组菌。

5.根据权利要求4所述的无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌，其特征在于，所述尿酸氧化酶工程菌为在ecn菌或ecn-δlpp菌的基因组中的uspg和rnk之间的非编码区域(689269-689288)、pnta和ydgh之间的非编码区域(1766918-1766937)分别整合了权利要求1至3任一项所述的尿酸氧化酶基因片段的重组菌。

6.一种权利要求4或5所述的无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌在制备降低尿酸的药物中的应用。

7.一种无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌的构建方法，其特征在于，所述底盘菌株为ecn菌或ecn-δlpp菌。

9.根据权利要求8所述的无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌的构建方法，其特征在于，所述尿酸氧化酶表达框整合进底盘菌株ecn菌或ecn-δlpp菌的基因组中的uspg和rnk之间的非编码区域(689269-689288)、pnta和ydgh之间的非编码区域(1766918-1766937)。

10.根据权利要求6所述的无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌的构建方法，其特征在于，步骤s2中，构建尿酸氧化酶表达框的启动子为p32，其序列如seq id no:2所示，终止子为t1，其序列如seq id no:5所示。

技术总结本发明提供一种无抗性标记的尿酸氧化酶工程菌及其构建方法。所述尿酸氧化酶工程菌为在基因组中整合了尿酸氧化酶基因片段，所述尿酸氧化酶基因片段包括信号肽PelB及尿酸氧化酶编码基因UOX，所述信号肽PelB的序列如SEQ ID NO:3所示，所述尿酸氧化酶编码基因UOX的序列如SEQ ID NO:4所示。本发明构建了无需抗性标记即可稳定表达的尿酸氧化酶的工程菌，并能有效降解尿酸。技术研发人员：徐炜,李源涛,朱笑蝶,张帮周,何剑全,肖传兴受保护的技术使用者：厦门承葛生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/11/18