一种提高冰冻切片质量的组织预处理方法与流程

本发明属于冰冻切片领域，具体是一种提高冰冻切片质量的组织预处理方法。

背景技术：

1、冰冻切片技术广泛应用于术中快速病理诊断。在手术过程中，医生可以迅速将取下的组织进行冰冻切片和染色处理，以明确病变的性质和范围，从而指导手术方案的制定和调整。冰冻切片技术还广泛应用于科研和教学领域。科研人员可以利用冰冻切片技术进行组织化学、免疫组织化学等研究；而教学人员则可以通过冰冻切片技术向学生展示组织的形态和结构特征。

2、现有的组织预处理步骤大致为利用低温条件使组织快速冷却到一定硬度，从而进行切片。这一过程需要精确控制冷冻温度和时间，以确保组织在冷冻过程中不产生过多的冰晶，从而保持组织的原有形态和结构。冷冻后的组织块被放置在切片机上进行切片，切片厚度一般为几微米至几十微米不等。切片后，根据需要进行染色处理，以便在显微镜下观察组织的形态和结构。

3、然而现有的组织预处理方法存在一定的局限性。例如，在切片后二次冷冻过程中组织内部容易产生冰晶，导致冰冻切片的形态和结构可能与初始冷冻时存在一定的差异；为此有必要提出一种提高冰冻切片质量的组织预处理方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种提高冰冻切片质量的组织预处理方法，用于避免组织样本内冰晶的产生，确保冰冻切片的形态和结构一致。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种提高冰冻切片质量的组织预处理方法，包括以下步骤：

3、步骤一，组织取材与初步处理：组织样本取材时，同时去除组织样本周边的杂质，然后将组织样本放置于吸水纸上，按压挤出脂滴；

4、步骤二，组织固定：将质量分数为4％的多聚甲醛溶液和65％的甲醇冰醋酸溶液混合搅拌得到固定液，对组织样本进行固定液加注，对于需深入脱水处理的组织样本，在阶梯浓度差为15％的bps中进行逐步脱水操作，直到组织样本沉到容器底部；

5、步骤三，组织冷冻：将组织样本加入包埋剂中进行包埋操作，包埋剂为oct，包埋剂的质量为组织样本质量的3-5倍；将包埋后的组织样本放入冷冻切片机；

6、步骤四，切片操作：调整冷冻切片机的切片厚度参数对包埋后的组织样本进行切片操作，得到组织样本切片，厚度参数区间为5-15μm；

7、步骤五，切片后处理：将组织样本切片先放入专用固定液装置进行二次固定液加注，如组织样本切片超过预设时间不使用时，则将组织样本切片放入专用冷冻装置进行二次冷冻处理。

8、基础方案的有益效果是：

9、1、去除组织样本的杂质可有效减少切片中的非目标成分，避免其对实验结果的影响。同时，按压挤出脂滴可以减少脂肪残留，使组织更加纯净。固定液的选择和脱水处理可有效稳定组织结构和形态，防止在后续处理过程中发生形变或降解。阶梯浓度蔗糖脱水能够逐步去除组织中的水分，同时保持组织的形态结构，使切片更加平整。

10、oct作为包埋剂具有良好的冷冻保护性能和切片性能，能够确保组织在冷冻过程中不受损伤，并保持其原有的形态结构。冷冻装置的选择则能够确保组织能够迅速而均匀地冷冻，减少冰晶的形成。调整切片厚度能够满足不同的实验需求，确保切片能够清晰地展示组织的结构和细节。二次固定液加注和二次冷冻处理能够进一步稳定切片的组织结构，防止组织在后续处理或保存过程中发生形变或降解。

11、2、专用冷冻装置通过控制冷风吹过组织样本切片的远近距离的同时不直吹组织样本切片，让冷风从组织样本切片侧边吹过从而实现双温控制，即在冷冻过程中通过不同的温度区域或阶段来控制冰晶的形成。同时，装置将组织样本分为两层进行冰冻，这种分层冰冻的方式有助于减少冰晶在样本内部的形成。双层冰冻结合双温控制，能够更有效地控制冷冻速度，避免冰晶对组织结构的破坏。在双层冰冻的基础上，进一步在样本表面覆盖一层疏水性材料。这种材料能够排斥水分，减少冰晶在样本表面的附着和形成，从而进一步保护样本的组织结构。通过双温控制、双层冰冻和疏水性材料覆盖的综合措施，有效减少组织样本在二次冷冻过程中冰晶的形成，保护样本的精细结构，提高切片质量。

12、3、专用固定液装置和冷冻装置的设计使得实验流程更加标准化、自动化，减少人为操作误差，提高实验效率和准确性。

13、进一步，步骤一中，组织取材时，选用厚度为2-3mm，大小为1-2cm的组织。

14、基础方案的有益效果是：

15、适当的组织厚度使得在冷冻过程中，组织能够更均匀地冷却，减少了因厚度不均而导致的冷冻速度差异，从而降低了冰晶形成的风险。较薄的组织层能更快地达到冷冻平衡，减少了冰晶在内部生成的可能性。薄而均匀的组织层在切片时更容易获得平整、连续的切片，减少了切片过程中的断裂和破碎现象。这有助于提高切片的完整性和质量，为后续的实验或观察提供了更好的样本。

16、进一步，步骤二中，采用固定液固定时，时间为8至15分钟。

17、基础方案的有益效果是：

18、设定固定的时间范围，24小时至36小时有助于减少实验过程中的不确定性，降低实验误差。这一时间范围能够确保组织得到充分固定，同时避免过度固定可能带来的负面影响。

19、进一步，步骤三中，使用样本托将组织样本放入冷冻切片机中前3小时，将样本托放置在冷冻切片机内预冷，并保持干燥。

20、基础方案的有益效果是：

21、预冷的样本托与冷冻切片机内的温度保持一致，使得组织样本在切片时更容易被切割，减少了切片过程中的阻力和摩擦力，从而提高了切片的效率和成功率。保持样本托的干燥状态，可以避免在切片过程中由于水分或其他液体的存在而导致的样本污染。清洁、干燥的样本托有助于获得更清晰的切片图像，并减少后续处理的复杂性。

22、进一步，步骤三中，调整冷冻切片机的冷冻温度，冷冻温度为-20℃至-80℃。

23、基础方案的有益效果是：

24、适当的冷冻温度可以迅速且均匀地固定和硬化组织样本，防止细胞内的水分结晶造成的物理损伤，从而最大限度地保持样本的原始形态和生物活性。这对于后续的切片观察和病理诊断至关重要。较低的冷冻温度使得组织样本更加坚硬且易于切片，减少了切片过程中的撕裂和变形现象。这有助于提高切片的平整度、连续性和清晰度，使得观察者能够更准确地判断样本的结构和细节。

25、进一步，步骤五中，切片时，每隔15s清理刀片上的组织碎片。

26、基础方案的有益效果是：

27、清理刀片上的组织碎片可以确保切片的连续性和清晰度。如果刀片上积累了过多的组织碎片，可能会导致切片不平整、有裂痕或重叠，从而影响后续的观察和分析。及时清理刀片上的碎片可以减少刀片的磨损，延长其使用寿命。刀片的磨损不仅会影响切片的精度，还会增加更换刀片的频率和成本。

28、进一步，步骤五中，对组织样本切片二次固定后，进行染色处理时，二次固定和染色处理的时间间隔为2分钟以内。

29、基础方案的有益效果是：

30、快速的二次固定能够进一步稳定组织切片的结构，减少在后续处理过程中可能发生的变形或损伤，从而保持切片的形态完整性和一致性。组织在二次固定后迅速进行染色，有助于染色剂更好地渗透到组织内部，使染色更加均匀、鲜艳，提高切片的染色质量。同时，短时间的间隔也减少了因组织干燥或其他因素导致的染色不良现象。

31、进一步，步骤五中，当组织样本切片进行二次冷冻时，将质量分数为85％聚四氟乙烯溶液放入喷液箱，在进行二次冷冻后，调整专用冷冻装置内温度为-70℃至-80℃，储存时间为1个月至3个月。

32、基础方案的有益效果是：

33、通过使用聚四氟乙烯溶液作为喷液箱中的溶液形成疏水材料层，在二次冷冻过程中能够有效防止组织内部冰晶的形成，保持切片的完整性和清晰度，为后续的实验或观察提供高质量的样本。将切片在-70℃至-80℃的低温下储存，可以显著延长切片的保存时间，从1个月到3个月不等。这种低温环境能够减缓生物样本的降解速度，保持其生物活性和形态结构。

34、进一步，步骤五中，专用固定液装置包括夹板和固定板，夹板和固定板一侧均固定连接有连接杆，相邻连接杆之间固定连接有伸缩杆和弹簧，伸缩杆上开有锁止旋钮，夹板和固定板通过连接杆、弹簧和伸缩杆滑动配合，夹板上开有若干交错相邻的固定液孔，固定液孔均固定连接有缓释层，固定板顶部固定连接有摩擦层。

35、基础方案的有益效果是：

36、固定板顶部的摩擦层提供了一定的摩擦力，有助于在固定过程中保持组织样本的稳定性。当夹板和固定板夹紧样本时，摩擦层能够防止样本滑动或移位，确保固定液能够准确地作用于目标区域。

37、通过调节夹板和固定板之间的夹持空间，使得固定液装置能够适应不同尺寸和形状的组织样本，确保固定液能够均匀地覆盖整个组织样本；通过缓释层使固定液缓慢均匀的渗透至组织样本，可有效的对组织样本进行保护，并确保固定液充分渗透至组织样本内部。

38、进一步，步骤五中，专用冷冻装置包括箱体、箱盖和制冷气泵，箱盖在箱体顶部铰接，箱体内侧壁上固定连接有制冷气泵，箱盖上开有若干通风孔，箱体底部固定连接有若干车轮，箱体内底壁固定连接有若干电磁块，电磁块上方滑动配合有若干磁铁滑动块，磁铁滑动块顶部固定连接有喷口，喷口上固定连通有冗余长度的伸缩管，伸缩管与制冷气泵固定连通，箱体内侧壁固定连接有导流板，导流板位于磁铁滑动块上方；

39、箱盖底部固定连接有红外测温仪，红外测温仪底部固定连接有固定杆，固定杆两侧的箱体内侧壁上均固定连接有喷液箱，喷液箱底部固定连通有锥形管，锥形管顶部固定连通有单向阀门，单向阀门输入口朝向锥形管，单向阀门输出口朝向配液箱内部，喷液箱靠近固定杆的内侧壁上固定连通有喷液管，喷液箱与喷液管的连接处固定连接有电动阀门，箱体远离制冷气泵的外侧壁上固定连接有控制器，控制器用于接收和调节制冷气泵、电磁块、红外测温仪和电动阀门的运行参数。

40、基础方案的有益效果是：

41、通过电磁块和磁铁滑动块的组合，以及制冷气泵的工作，装置能够在箱体内形成不同的温度区域。磁铁滑动块在电磁力的作用下可以在箱体内底壁上方滑动，从而调整喷口的位置和数量，实现局部温度的精确控制。

42、喷液箱和喷液管的设计允许在冷冻过程中向样本表面喷洒疏水性材料，如聚四氟乙烯溶液，以减少水冰晶形成。

43、通过精确的温度和湿度控制，确保样本质量，为后续的染色、观察等实验步骤提供高质量的样本。